种子园是由优树无性系或家系组成的，以生产优质种子为目的的特种林分，经营种子园的重要目的是为林业生产提供大量遗传品质优良的种子。而传粉受精是影响种子园种子品质的关键，并且对幼苗的成活率也有很大影响(Woods et al., 2002)。因此，了解种子园内传粉受精的实际情况对于种子园经营有着现实意义。交配系统是对生物有性繁殖过程中配子结合类型、模式、影响因素和机制的状态反应，包含了传粉受精的全部过程。异交率是交配系统的特征参数，以往对异交率的估测主要是以同工酶为主(王崇云，1997；Burczyk，1998)。但同工酶只能分析那些编码酶的基因，对于整个基因组而言，其研究的位点数及每个位点能检测的等位基因数均有限，并且对取材要求严格，酶活性易受环境和生理的影响，造成了其应用的局限性。20世纪80年代以来，随着分子标记的发展和应用，分子标记技术已经逐步应用于交配系统的研究中(董贞荣等，2006)，但至今未见利用该技术研究实生种子园交配系统。本文将运用SSR标记系统分析马尾松(Pinus massoniana)实生种子园的交配系统，旨在为现有种子园的遗传管理提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料概况

以福建省上杭县白砂林场的马尾松实生种子园为对象。该种子园于1990年9月开始育苗，1991年6月上山定植，共56个家系，试验设计为完全随机区组，单株小区，40区组，占地约6.67 hm²。到目前为止，种子园已经过2次疏伐，强度分别为30%和40%。授粉期利用鼓风机进行人工风力辅助授粉。

1.2 样品采集及处理

2006年在56个家系中随机抽取14个家系，每个家系随机取3单株，每个单株抽取10粒种子培养子代苗。另外根据种子园的地理分布随机抽取了7个家系进行单株不同方位采种，每株树按东、南、西、北4个方位采种，每个方位随机抽取5粒种子培养幼苗。

2007年在56个家系中随机抽取22个家系进行分层采种，每个家系取1株，将树冠分为上、中、下3层，每层采集10个球果，从每层种子中随机抽取10粒种子培养子代苗。

种子处理：用1 g·5L^-1 NaOH溶液浸泡球果48 h，取出后放入48 ℃左右鼓风烘箱中鼓风烘烤48 h，敲打球果，收集种子。将种子摆放在发芽盒内，25 ℃光照培养箱中发芽。在幼苗长到大约5~6 cm时取出，去除种壳和残余胚乳，将整株幼苗放入-70 ℃冰箱中保存。

1.3 总DNA的提取

采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法从幼苗中提取总DNA(张博等，2005)。

1.4 SSR-PCR扩增

反应总体积为10 μL，其中包括15 ng左右的模板，1×Buffer缓冲液，25.5 mmol·L^-1 MgCl₂，200 μmol·L^-1 dNTP，0.5 μmol·L^-1引物(R&F)，0.4 U(5 U·μL^-1)Taq酶(Takara生产)。PCR扩增反应程序采用Touchdown-PCR扩增程序(王天云等，2003)。扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、银染、拍照。

1.5 引物筛选

本研究应用的SSR引物为马尾松引物63对。松属内同源物种的引物共152对，其中140对是已经公布的属内物种引物：火炬松(PT，Pinus taeda)108对，辐射松(PR，P. radiata)28对和NZPR(P. radiata in New Zealand)5对，欧洲赤松(SPSY，P. sylvestris)6对和瑞士五针松(APC，P. cembra)5对；另外12对引物是利用GeneBank中的火炬松EST序列设计的微卫星引物(王鹏良，2006)。

随机选择1个DNA样品对215对引物进行PCR扩增，筛选出有产物、主带明显的引物130对，所占比例为60.47%；然后用8个DNA样品对初筛得到的引物进行复筛，筛选出多态性较好并无缺样的引物6对(表 1)，部分复筛图片见图 1。

1.6 数据分析

采用小源凝胶图像分析系统对所得图片进行判读。运用Ritland的混合交配系统模型MLTR程序估计单位点异交率、多位点异交率及其标准差等(Ritland, 2002)。

2 结果与分析 2.1 种子园2个年份交配系统的分析

利用MLTR程序分析2006、2007年的子代数据，得到其多位点异交率t_m、单位点异交率t_s、近交指数和固定指数(表 2)。由6个位点共同估算的多位点异交率2007年为1.072(SD=0.066)，显著高于马尾松无性系的0.792(赖焕林等，1997)，稍高于油松(Pinus tabulaeformis)种子园的0.962 (张冬梅等，2000)。2006年的t_m=1.200(SD=0.000)，高于2007年。单位点异交率2007年为1.175(SD=0.037)；2006年为1.200(SD=0.008)。2006年也稍高于2007年，可能是2007年种子授粉期多雨所致。2年的近交指数均较低，说明该种子园近交现象不显著。2007年的固定指数F接近于0，说明种子园处于Hardy-Weinberg平衡；2006年的固定指数F小于0，说明其杂合子过剩。位点PTest1的部分样品扩增银染图如图 2。

以RPTest11、PtTx2123、PtTx3013、PtTx3088、PtTx2146、PTest1共6个位点分别估算单位点异交率(表 3)，再求得它们算术平方和为1.092(2007)和1.181(2006)；而由6个多态位点共同估算所得的单位点异交率为1.175(2007)和1.200(2006)(表 2)。可见2种不同方法求得的单位点异交率估算值存在差异。事实上，估算过程中偏离混合交配系统模型的一些假设对多位点估算影响小，而对单位点估算影响大(Brown et al., 1985)。因此在具体估算时建议尽量采用多位点的估算方法。

2.2 种子园空间上交配系统的分析

对2007年种子进行了树冠不同部位异交率研究，对2006年种子进行了方位上异交率的比较。由表 4可见，无论是多位点异交率还是单位点异交率都是上层最高，下层最少，与欧洲赤松的研究结果相似(Shen et al., 1981)。花量调查发现：该种子园雌球花主要集中在中上层，雄球花集中在中下层(方彦等，2007)。当雌雄球花花期相当时，上部的雌花更有机会接受外来花粉，异交率随之增大。该种子园的中层与下层的异交率相差较小，这一结果与花量调查的结果相对应，说明花量与交配系统间存在一定的联系。

由表 5可见东面的多位点异交率明显小于南、西、北面。这与单株在种子园所处的地理位置、环境因子有一定关联。该种子园背朝东面，东面的花量相对而言少于另3个方向，且授粉期以东南风为主，导致了东面的多位点异交率相对较小。

2.3 种子园坡向间交配系统的分析

该种子园的坡向主要是西和北，在采集种子时，对其坡向进行了分类，其中9个家系处于正西坡，9个家系处于正北坡，另4个家系处于西北坡。本试验仅取前18个家系进行交配系统比较(表 6)。多位点异交率在两坡间基本一样，说明坡向可能对异交率的影响很小。由于此结果仅考虑了2个环境较相似的坡向，且只做了单年份的分析，因此准确的相关结论仍有待深入分析。

2.4 种子园家系间交配系统的分析

对2007年选取的22个家系进行交配系统分析(表 7)，并对家系间的异交率分布情况作图(图 2)，发现各个家系间的多位点异交率和单位点异交率具有一定的差异。多位点异交率变化幅度为0.939~1.200，有22.73%家系的多位点异交率在0.9~1.0之间，有68.18%家系的多位点异交率为1.2，两者相差比较大。而单位点异交率变化幅度为0.986~1.200。这种差别归结于个体自交可育程度的差异、自身花粉的充裕程度以及所处的地理环境。对家系间异交率的差别分析要分清其自交是遗传因素导致的，还是环境因素导致的，准确的结论可为家系选择提供帮助。

由图 3可见，多位点异交率与单位点异交率的家系分布差别很大。多位点异交率主要集中在0.9~1.0和1.2两区段，而单位点异交率基本分布在1.0~1.2。单位点检测只需检测母本或子代的一个位点基因型，在“混合交配模型”的假设条件下，用最大似然方法估计模型中的交配指标，因其检测位点单一，当所研究植物居群的实际情况与4个假设偏离时，所得出的估算值将受到较大影响。而多位点模型中，交配事件分为确定性交配和非确定性交配，因此当植物居群的实际情况与混合交配系统4个假设偏离时，不会对多位点分析的估计结果产生太大的影响(Ritland, 2002)。从这一分布图可间接说明多位点异交率与单位点异交率两者的差异。

3 结论与讨论

对于2006年和2007年交配系统的分析发现，该种子园的异交率较高，多位点异交率分别为1.200(SD=0.000)和1.072(SD=0.066)，高于由同工酶所得的结果(王崇云，1997；Burczyk，1998)。其原因可能有：第一，根据实地考察，该种子园的群体面积较大，密度适中，结实母株呈连续分布状态，群体内的基因流动较强；第二，近年内该种子园积极采用人工吹风辅助授粉，进一步加强了其基因流动；第三，本文所采用的SSR标记能显示同工酶等标记所检测不出的等位基因(高翔等，2002)。对于本文的异交率普遍大于1，除以上3点原因外，可能还由于“负向”同型交配或抽样误差产生(EI-Kassaby et al., 1986)。另外，根据实地考察与SSR分析发现，15、203号家系的遗传多样性指标均高于其他家系；从表 7也可以看出其多位点异交率也处于很高水平。虽然，在实地采种时已经尽量避免采集靠近子代测定林的母树，但是，花粉飞散可能导致该种子园受到外来花粉的污染，由于外来花粉携带着有异于该种子园的等位基因，这为加大该种子园的异交率提供了物质基础。

对2007年的种子进行了分冠层和坡向初步研究，对2006年种子进行了方位上异交率的比较。发现异交率大小为：上层>中层>下层；西坡=北坡；东面＜南面=西面=北面，这一结果基本与花量调查的结果相一致(方彦等，2007)，说明了花量与交配系统间存在一定的联系(Denti et al., 1988)。

对该种子园的22个家系的异交率比较发现，各家系间差异不显著。说明该种子园的家系选择和配置上比较理想。另外，异交率在年度间差异不大，并都处于较高水平，初步说明利用该种子园良种造林的风险较小，当然仍需多年度间差异的进一步研究，以期获得更确切的结论。

一些学者研究发现，对于风媒授粉树种，种子园中较高的自交率导致子代群体经济性状较大分化和平均水平的下降(赖焕林等，1997；Brown，1990)，并且影响种子的生产效率，产生大量空籽(王晓茹等，1989；张华新等，2002)，合理的设计和配置家系或无性系是种子园保持高水平异交率的关键。本试验所得到的数据显示该种子园营建时家系选择和配置比较成功，自交不明显。为了保持此现状，应进一步从影响交配系统的众多因子出发，可以通过密度管理、树体管理、花粉管理、花量的调控等措施，减少自交的不良影响，以达到提高种子园产量与品质的双重保证。