细根是分布于根系先端直径较小的根。与作物相比，多年生木本植物细根具有更复杂的分枝等级(即根序，Root order)和年龄结构(Pregitzer et al., 2002)。细根死亡后释放到土壤中的C和N甚至超过地上枯枝落叶分解所贡献的18%~45%(John et al., 2002)。越低级的细根产生越晚，年龄越小，贡献越大。低级根内氮含量较高，呼吸代谢旺盛，比高级根更易发生衰老死亡(Pregitzer et al., 2002)。除细根自身因素外，许多环境因子也可以促使细根提前衰老死亡。土壤水分状态在森林生态系统细根生产、死亡和周转过程中发挥重要作用(Hendricks et al., 2006)，其中土壤干旱胁迫可能是引起根系衰老死亡的原因之一(Bryla et al., 1997)。在挪威云杉(Picea abies)细根周转研究中发现干旱胁迫下细根显著衰老，寿命降低(Majdi et al., 2005)；在北方硬阔叶林中，适当浇水处理可以促进细根生长、减少衰老、延长寿命(Pregitzer et al., 1993)。尽管人们认识到干旱胁迫对细根生长具有不利的影响，但对于不同根序的生理生化反应，并没有深入的探讨。从而不能清楚的认识土壤水分缺乏时不同根序细根在细根周转中的作用。

土壤干旱是东北地区春季造林的主要限制因子之一。水曲柳(Fraxinus mandshurica)是东北地区具有较高生态和经济价值的珍贵造林树种，且其根系具有发达的分枝结构(王向荣等，2005)，也适宜作为细根生物学研究的材料，尤其是根序研究。Guo等(2008)对23个温带树种前5级根的解剖结构研究发现，70%树种的细根主要存在于前2级根中。本文采用干旱胁迫处理水曲柳苗木，研究干旱胁迫下1，2级根系活力和细胞膜透性等生理功能变化，分析1，2级根对干旱胁迫反应的异同；同时，研究根细胞保护酶系统(POD，CAT，SOD)的活性变化，探求细根膜透性变化、根系活力与保护酶活性的关系，进一步揭示干旱胁迫对水曲柳细根生长的影响，为指导水曲柳苗木水分管理提供更多参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验于2006年4—10月在东北林业大学林木育种实验站温室内进行，盆栽土培。挑选生长均匀的一年生水曲柳幼苗，于4月下旬栽植于塑料容器中(直径30 cm，高37 cm)，每个容器栽植2株，共30桶。全部植株每2天正常浇灌1次(平均每次每桶1 500 mL)，人工清除杂草，定植培养3个月后(7月下旬)停止浇水，进行自然干旱处理。

1.2 试验方法 1.2.1 材料处理

待苗木全部整齐成活后(平均苗高为34 cm，平均地径为1.1 cm)7月27日开始干旱处理：15桶进行停止浇灌，作为自然干旱处理；15桶作为对照正常浇灌。分别于自然干旱后第15，30和40天时取样，并用TDR300土壤水分监测仪(Spectrum，USA)测量土壤含水量，15，30和40天时土壤含水量分别为35%，20%和2%。

在3次取样过程中，每次取5桶，共10株苗木。将整株根系连同土壤从桶中取出，小心去除根系表面的大块泥土，迅速装入塑料袋中，保存在装有冰块的塑料桶内，带回实验室。剪去地上部分，将根系置于2~4 ℃冰水(去离子水)中，小心洗净并分剪出几个完整的根系分枝，放入1 ℃去离子水的玻璃皿中。按照Pregitzer等(2002)的方法，分取位于根系分支顶端的1级根(距根茎基部最远的根)和它的母根2级根(1，2级根平均直径分别为0.34 mm，0.36 mm)。每次取样各级细根鲜重约5 g，以满足生理指标分析。

1.2.2 指标测定

根系活力测定采用TTC染色法(袁晓华等，1983)。膜透性用相对电导率法(李合生，2001)。可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝比色法(李合生，2001)。SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法(Giannopolitis et al., 1977)。POD活性采用愈创木酚法测定(Cakmak et al.1992)。CAT活性参考Beers和Sizer紫外分光光度法并加以改进，在25 ℃恒温条件下和3 mL反应体系中，包括0.2% H₂O₂ 1mL，缓冲液1.9mL，再加入100μL稀释的酶液，计时并立即用紫外分光光度计测定240 nm的光密度值，每隔30 s读1次，共读3 min。以光密度对时间作图，取反应最初直线部分，计算出每分钟光密度的减少值，以单位时间每克植物材料的光密度变化0.001为1个过氧化氢酶活性单位(U)。全部生理指标测定均重复3次。

1.3 数据分析

每个指标采用SPSS软件包(v11010，SPSS Inc，Chicago，Illinois，USA)进行方差分析，然后进行LSD检验(α=0.05)，采用SigmaPlot(Version 9.01，USA)软件进行示图制作。

2 结果与分析 2.1 根系活力变化

根系活力降低是细根衰老的最早生理表现形式之一。与对照相比，干旱胁迫导致细根活力显著下降，随时间延长下降明显(表 1，图 1)。胁迫处理初期(15天)，1级根每小时每1克鲜质量还原TTC 156.65 μg，比对照下降20%(P＜0.05)(图 1A)，2级根活力变化不显著(P>0.05)(图 1B)，但是，在干旱处理30和40天，1级根(图 1A)和2级根(图 1B)活力显著低于对照(P>0.05)。虽然根序对活力影响不显著(P=0.059，表 1)，但是1级根活力在30和40天下降幅度大于2级根，表明1级根对干旱胁迫比2级根敏感。此外，干旱处理与处理时间具有明显的交互作用，但是，处理与根序，根序与时间，以及3者之间的交互作用不明显(表 1)。

2.2 膜透性变化

膜透性是表征细胞结构完整性的主要特征之一。研究表明：胁迫处理、胁迫时间及根序对膜透性变化产生显著影响(表 1)。膜透性与根活力(图 1)变化呈显著负相关(r²=0.65，P＜0.05)。与对照相比，胁迫处理初期(15天)1级根膜相对电导率为10.7%，显著高于对照(P＜0.05)(图 2A)，2级根透性增加不明显(P>0.05)(图 2B)。随着胁迫时间延长(30~40天)，1级根膜透性增加幅度高于2级根：1级根从32%(30天)增加到72%(40天)，2级根从33%(30天)增加到65%(40天)，与对照的差异在30和40天都达到显著水平(P＜0.05)，表明1级根衰老程度大于2级根。但是，根序与时间2者之间，以及与处理3者之间交互作用不显著(表 1)。

2.3 可溶性蛋白含量变化

干旱胁迫处理对可溶性蛋白含量产生显著的影响，同时随着胁迫时间延长，各级根可溶性蛋白含量均明显下降(P＜0.05)(表 1，图 3)。可溶性蛋白含量与膜透性(图 2)呈显著负相关(r²=0.61，P＜0.05)，与活力(图 1)呈显著正相关(r²=0.87，P＜0.05)。与对照相比，胁迫初期(15天)和中期(30天)，可溶性蛋白含量增加，但是与对照之间的差异不稳定(如1级根15天时差异显著，2级根30天时差异显著)，而到胁迫后期(40天)，1级根与2级根才比对照显著降低(P＜0.05，图 3)。说明轻度干旱胁迫可促进可溶性蛋白的合成，而重度(或长期)干旱胁迫时，蛋白质合成能力减弱(或降解过程加强)。在整个胁迫处理过程中，1级根可溶性蛋白含量比2级根下降幅度明显，40与15天相比分别下降了68%(1级根，图 3A)和58%(2级根，图 3B)。除了根序与处理时间存在交互作用外，其余的交互作用差异均不显著(表 1)。

2.4 SOD，CAT，POD活性变化

保护酶活性变化是细胞衰老(尤其是膜脂过氧化)和环境胁迫过程中生化反应程度的重要指标。3种保护酶(SOD，CAT，POD)活性在不同处理、不同根序和不同处理时间上均受到显著影响，而且2者之间具有明显的交互作用(表 1)。与对照相比，干旱胁迫处理导致3种保护酶活性增加(SOD 40天除外)，其中，CAT和POD增加显著(P>0.05，图 4C~F)，SOD仅在15和30天(1级根)以及30天(2级根)增加显著(P>0.05，图 4A、B)。3种保护酶活性变化规律不同，SOD活性呈先上升后下降的趋势，而CAT和POD活性均随胁迫时间延长持续下降(图 4)。40天后1级根CAT活性和POD活性分别为23.4和35.8 U·mg^-1 min^-1，与干旱胁迫处理初期(15天)相比下降了46%和38%，而2级根仅下降了11%和33%，表明1级根保护酶活性受干旱胁迫影响大于2级根。

3 讨论

本研究发现：在干旱胁迫条件下水曲柳苗木细根活力下降、细胞质膜透性增加、可溶性蛋白含量减少(图 1~3)，3个生理指标之间具有明显的相关性(r²=0.61~0.87，P＜0.05)，与魏道智等(2004)和石岩等(2001)在小麦(Triticum aestivum)根系衰老研究中变化趋势相似。遮荫胁迫处理时水曲柳苗木根系衰老研究也发生了根系活力下降、膜透性增加、可溶性蛋白含量下降等衰老现象(徐文静等，2006；宋纯鹏，1998)。干旱胁迫导致细根发生衰老死亡的原因可能也是影响到光合产物在细根中的分配。Hartung等(2002)研究表明干旱胁迫时根系会产生化学信号传送给茎，降低根、茎的生长速度，使地上部位光合能力下降。同时，土壤水分不足常常导致气孔关闭，CO₂同化速率也降低(李靖芳等，2007)。在干旱条件下根系呼吸短时间内更强(Pregitzer et al., 1998)，要消耗大量光合产物维持根系正常生理活动(Farrar et al., 2000)。净光合产物及分配到根系中的光合产物会大量减少(Nadelhoffer，2000)。因此，Eissenstat等(1997)认为碳供给不足及碳需求增加的矛盾是干旱胁迫时导致细根生长缓慢、活力降低，甚至死亡的直接原因。

本研究也发现：在胁迫处理15和30天时，可溶性蛋白含量显著高于对照，分析可能是胁迫初期，抗氧化酶系合成增加所致。但到胁迫40天时可溶性蛋白含量低于对照，这可能由于在重度干旱胁迫条件下，细胞体内大量活性氧会损伤DNA的复制过程，使细胞蛋白质和核酸的合成能力减弱(宋纯鹏，1998)，引起可溶性蛋白含量的减少。由此可见，细根内蛋白质合成能力减弱可能是造成干旱胁迫下蛋白质含量下降，细根活力减弱，发生衰老死亡的又一因素。

细胞维持正常的生理代谢活动，需要相对稳定的内环境，这主要是膜系统提供的。叶片在胁迫环境可以导致细胞膜透性增加，使细胞及膜相细胞器内稳定生理生化环境破坏，最终导致细胞器生理功能丧失，细胞衰老死亡(Buchanan et al., 2000)。与叶片相似，胁迫条件下，根膜透性增加主要也是由于大量活性氧积累，膜脂过氧化造成的(宋纯鹏，1998)。陈明等(2004)研究发现盐胁迫处理小麦幼苗根系，8 h后根中H₂O₂含量就迅速增长为对照的1.89倍， 生成量在48 h后达1.6 nmol·min^-1g^-1FW，是对照的2.67倍。另外，盐胁迫(Katsuhara et al., 1996)及铝胁迫(Pan et al., 2001)处理下，活性氧伤害均能明显增加大麦(Hordeum vulgare)根尖细胞透性，导致根尖细胞凋亡。本研究发现：干旱处理15天后，SOD活性在1级根中比对照增加了27%(图 4A)，说明根系在干旱胁迫时会产生大量的 ，诱发SOD活性升高(宋纯鹏，1998；李清芳等，2007)。但随胁迫强度的加重，到40天时SOD活性显著低于对照，表明其歧化 的能力减弱。 是细胞衰老过程中最先大量产生的活性氧分子，是引发细胞氧化还原状况改变的信号(Buchanan et al., 2000)。在根细胞正常的呼吸代谢过程中，线粒体呼吸链中的辅酶Q(UQH₂)氧化形成UQ，也能产生的 。在胁迫条件下，如线粒体电子传递链受损，呼吸产生的 不能及时清除，便会造成 氧化伤害线粒体膜(宋纯鹏，1998)，导致细胞呼吸代谢功能减弱和活力降低。

CAT和POD是清除H₂O₂分子的主要酶类。与对照相比胁迫15天时1级根中CAT和POD分别增加了183%和307%；处理30天后，分别增加了183%和635%，2级根中这2个酶的活性也有成倍增加(图 4C~F)。这充分说明根系在干旱胁迫时会产生大量的H₂O₂。除SOD催化O₂^-产生H₂O₂外，线粒体外膜的许多酶类(如单胺氧化酶，黄素蛋白酶类)均可将O₂直接转化成H₂O₂(宋纯鹏，1998)。当线粒体结构和功能受到破坏时，H₂O₂会显著升高(宋纯鹏，1998)。与对照相比，胁迫后期(40天)CAT和POD活性均显著高于对照，说明此时细胞内H₂O₂含量仍然较高。但与胁迫初期(15，30天)相比，2者活力显著下降，对照则变化并不明显(图 4 C~F)。说明随胁迫时间延长，CAT和POD活性也呈下降趋势，细胞抗氧化能力逐渐减弱，膜质氧化伤害程度增加。本研究发现随干旱胁迫时间延长，根细胞膜结构受损，膜透性(电解质渗漏)增加(图 2)，细根活力下降(图 1)，根活力与膜透性变化呈显著负相关(r²=0.65，P＜0.05)。可能也与线粒体结构和功能变化(如代谢产生过多的活性氧分子)有关，这还需在下一步实验中证实。

1级根是2级根的子根，是根分支系统中产生最晚的根系，具有发达的皮层薄壁组织。与2级根相比，1级根内具有更高的N浓度，呼吸代谢旺盛，吸收及消耗土壤中更多的养分和水分，寿命比高级根短(Pregitzer et al., 2002)，对土壤环境变化反应也最敏感(Hishi，2007)。本研究干旱处理15天时，1级根活力(图 1)、膜透性(图 2)和可溶性蛋白含量(图 3)就与对照出现明显差异，而2级根差异则不显著。随着干旱胁迫时间的延长，这3个指标变化幅度均大于2级根。同样，在胁迫过程中，1级根SOD酶活性也显著高于对照，2级根活性虽高于对照但差异不显著(图 4)。随着胁迫时间的延长，1级根各酶下降幅度也均大于2级根。说明1级根抗氧化酶系活性较2级根减少更明显，发生膜质氧化的可能性也更高。这与徐文静等(2006)在碳胁迫下观察到的细根膜透性变化相同，进一步证明胁迫条件下1级根受环境影响最大，最容易死亡。

4 结论

本研究发现干旱胁迫可导致1年生水曲柳苗木细根活力降低、膜透性增加、可溶性蛋白含量下降，而且1级根比2级根变化明显，证明发育最晚的1级根对干旱胁迫反应最敏感。尽管干旱胁迫下保护酶活性变化与膜透性、细根活力变化具有密切的相关性，但仍需对活性氧产生的主要细胞器-线粒体结构和功能进行详细的研究，以进一步验证干旱胁迫下氧化伤害是造成细根生理功能变化的主要原因。所以我们要充分认识到水分对1年生水曲柳苗木根系生长的重要影响，在抚育过程中做好浇水灌溉，防止造成根系生理伤害，影响苗木成活。