兴安落叶松鞘蛾(Coleophora obducta)在落叶松(Larix spp.)叶部潜叶危害，在我国东北林区的落叶松林内常暴发成灾，危害严重时，整片林分状似火烧，严重影响树木的生长和发育，甚至会导致大量林木枯死，造成很大的经济损失(杨立铭等，1990；郝玉山，2003)。由于其幼虫具有潜叶取食的特殊生活习性，目前尚没有有效的方法从根本上控制其猖獗危害。

植物挥发性物质大多具有一定的“气味”，这类物质作为昆虫行为的化学信号物质，在植物之间以及植物与昆虫之间起重要作用(邓晓军等，2000)。植物挥发物在昆虫寄主识别机制中的作用，是近年来森林健康和森林害虫化学生态与综合治理研究领域的热点，并且植物挥发物在害虫监测中也起着重要作用(Ioriatti et al., 2003)。因此，本研究旨在通过对兴安落叶松鞘蛾进行生物测定，初步筛选出对鞘蛾有生物活性的植物挥发性物质，为大规模林间防治提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试昆虫

兴安落叶松鞘蛾采自黑龙江省哈尔滨市宾县落叶松林内，4，5月份将带鞘的落叶松枝条一并采回实验室，一部分直接用于幼虫取食试验，一部分在室温条件下置于60目养虫网内，网内放置若干健康的兴安落叶松(L. gmelinii)盆栽苗为幼虫提供足够的食物，待成虫羽化备用。

1.2 供试植物

兴安落叶松4年生盆栽苗，幼苗管理严格，避免受到外界人为机械损伤及病虫危害，选择健康、长势相似的落叶松苗用于生物测定。

1.3 落叶松挥发物标样

共测试落叶松9种挥发物标样(刘英胜，2006)(表 1)。

1.4 鞘蛾成虫对挥发物的触角电位(EAG)反应

用触角电位仪(IDAC-4、CS-55，荷兰Syntech公司)测试落叶松鞘蛾雌、雄虫触角对0.4 mol·L^-1的9种落叶松挥发物标样(表 1)的电生理反应。以0.5 cm×1 cm×2 cm梯形滤纸条对折作为溶液载体，分别滴加10 μL挥发物在滤纸上作为气味源置于巴斯德管内，对照滴10 μL液体石蜡(化学纯，天津市泰兴试剂厂)。取新羽化的鞘蛾，用锋利刀片将触角自基部切下，并切除触角末端约0.3 mm，用导电胶固定在电极上。气味管距触角1 cm，对准触角中央。刺激时间0.1 s，刺激间隔30 s以上，待触角感受完全恢复。每根触角每种物质平行测定5次，测试6根触角，记录电位值。

1.5 鞘蛾成虫对挥发物的嗅觉反应

1)供试落叶松挥发物标样溶液的配制 将表 1中的9种物质均配制成0.000 4，0.004，0.04，0.4，0.8 mol·L^-1等5个浓度梯度的石蜡溶液，在漩涡混合器上混合均匀，以石蜡油为对照。

2)生测方法 测试兴安落叶松鞘蛾雌、雄虫对9种落叶松挥发物标样的行为反应，生物测定装置为改进的自制玻璃“Y”型管，管的两侧臂等长，为10 cm，夹角75°，内径2.5 cm；适应臂长20 cm，内径3 cm；三角形陷阱底部直径8 cm。两侧臂分别用硅胶管依次连接三角形陷阱、气体采样仪[QC-1(B)型，北京市劳动保护科学研究所]及活性炭空气过滤装置。Y型管嗅觉仪置于封闭小室中，其上为2盏40 W荧光灯，与Y型管平行，使光线均匀。测试前，开启实验室的排气扇换气2 h。测试时，以2 cm²滤纸上滴10 μL挥发物作为气味源，对照滴10 μL石蜡油，分别置于三角形陷阱内。有气味源的一侧为处理壁，另一侧为对照壁。调节气体采样仪的气体流量为400 mL·min^-1。

取新羽化的未交配鞘蛾雌、雄成虫，从引虫口单只引入。生测行为选择标准(Natale et al., 2004；Tooker et al., 2005)如下：在5 min内成虫飞入侧臂超过2.5 cm，并保持1 min，则认为对壁内物质有趋向反应，否则认为无反应。每种物质每种浓度测试30只，为避免光线、气流等可能造成的误差，每测试3只调换1次Y型管2侧臂方向，并更换新的三角瓶及滤纸。同种物质测试浓度按从低到高进行。更换不同物质气味源时用酒精擦拭Y型管，自然晾干以消除残留气味。初步筛选出对鞘蛾有活性的植物源诱引物、驱避物及其浓度。

雌虫在寄主定向、定位、产卵场所选择等方面更依赖于对寄主植物挥发物的有效利用，因此，本研究筛选出对雌虫有活性的挥发物成分进行对盆栽苗的试验，即筛选出的对鞘蛾雌虫有明显诱引活性和驱避活性的挥发物及其浓度分别为：S-α-蒎烯0.04，0.004 mol·L^-1，S-β-蒎烯0.000 4 mol·L^-1，水芹烯0.04、0.000 4 mol·L^-1，3-蒈烯0.000 4，0.04 mol·L^-1，月桂烯0.004，0.8 mol·L^-1和叶醇0.04 mol·L^-1。

1.6 鞘蛾幼虫对喷施不同挥发物的苗木的取食反应

兴安落叶松鞘蛾越冬后的幼虫即老熟幼虫有暴食性和转叶取食习性，对落叶松危害最为严重。于4月末、5月初待落叶松刚刚放叶，幼虫出蛰开始取食危害时将带鞘的落叶松枝条采回实验室，连同结鞘针叶一并取下，每10 cm样枝上接20只幼虫到健康落叶松盆栽苗，每盆“接种”3个样枝，待“接种”幼虫全部侵入叶内定居后(若发现幼虫逃逸或死亡及时补充幼虫)，将1.5筛选出的每种活性挥发物分别单个喷施于每样枝上200 μL，各盆相隔1 m，对照苗喷等量石蜡油，试验设置3个重复，观察统计鞘蛾幼虫取食和死亡情况。

1.7 数据统计及分析

1) EAG反应值由触角电位仪自动读出。

2) 生测反应的驱避率、诱引率及反应率，公式(严善春等，2003)如下：

驱避率=(对照臂内总虫数/测试总虫数)×100%；诱引率=(处理臂内总虫数/测试总虫数)×100%；反应率=(对照臂内总虫数+处理臂内总虫数)/测试总虫数×100%。

3) 幼虫取食试验的驱避率、致死率，公式如下：

驱避率=(转移幼虫数/测试总虫数)×100%；死亡率=(死亡幼虫数/测试总虫数)×100%；校正死亡率=(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100%。

4) 以Tukey-HSD多重比较，分析鞘蛾对不同挥发物之间触角电位的差异。

5) 以配对t检验，分析触角电位反应在雌、雄虫之间的差异显著性。

6) 以单因素方差分析，检验鞘蛾幼虫取食与对照之间的差异显著性。

7) 以χ²检验分析生测试验中挥发物对鞘蛾成虫诱引、驱避的差异显著性。

2 结果与分析 2.1 鞘蛾对9种挥发物的EAG反应

鞘蛾雌虫对寄主植物9种挥发物0.4 mol·L^-1浓度的EAG反应结果(图 1)表明，除对R-α-蒎烯没有明显电位反应外，对其余8种均有明显的电生理反应，与对照相比差异显著(P < 0.05)，其中，对S-α-蒎烯和月桂烯反应最强烈，与对照相比差异极显著(P < 0.01)，而对其他6种挥发物EAG反应的程度相似。雄虫除了对R-α-蒎烯和水芹烯没有明显电位反应外(图 1)，对其余7种均有明显的电生理反应，与对照相比差异显著(P < 0.05)，其中，对S-α-蒎烯、3-蒈烯和月桂烯反应最强烈，与对照相比差异极显著(P < 0.01)，而对其他5种挥发物EAG反应的程度相似。

此外，雌、雄虫对挥发物的敏感度不同(图 1)，雌、雄成虫对R-α-蒎烯、S-α-蒎烯和水芹烯的电位反应无显著差异(P>0.05)；雌虫对叶醇的电生理反应显著大于雄虫(P < 0.05)；雄虫对S-β-蒎烯、罗勒烯和3-蒈烯的反应显著大于雌虫(P < 0.05)，且对莰烯的触角电位反应极显著大于雌虫(P < 0.01)。

2.2 鞘蛾成虫对9种挥发物的嗅觉反应

鞘蛾雌、雄成虫对寄主植物9种挥发性物质均能够产生嗅觉反应(表 2)，反应率都在75%以上，表现为物质不同，浓度不同，成虫的趋向反应亦不同。其中，雌虫对S-α-蒎烯、S-β-蒎烯、水芹烯、3-蒈烯、月桂烯、叶醇这6种物质，雄虫对罗勒烯、月桂烯、莰烯、叶醇这4种物质在一定浓度下表现为明显的趋向偏好。

对于雌虫而言(表 2)，S-α-蒎烯在浓度为0.04 mol·L^-1时有驱避作用，驱避率为诱引率的4.33倍；浓度为0.004 mol·L^-1时对雌虫有诱引作用，诱引率为驱避率的1.71倍，在这2种浓度下的驱避、诱引作用差异显著(P < 0.05)。S-β-蒎烯在浓度为0.000 4 mol·L^-1时诱引作用强，诱引率为驱避率的2.17倍，二者差异极显著(P < 0.01)。水芹烯在浓度为0.000 4 mol·L^-1时有驱避作用，驱避率为诱引率的3.75倍；浓度为0.04 mol·L^-1时表现为诱引作用，诱引率为驱避率的2.25倍，二者差异显著(P < 0.05)。3-蒈烯在浓度为0.000 4 mol·L^-1时诱引作用较强，诱引率为驱避率的2.40倍；浓度为0.04 mol·L^-1时诱引作用最强，诱引率为驱避率的3.33倍，二者差异显著(P < 0.05)。月桂烯在浓度为0.004 mol·L^-1时驱避作用强，驱避率为诱引率的4.33倍，二者差异显著(P < 0.05)；浓度为0.8 mol·L^-1时驱避作用最强，驱避率为诱引率的7.50倍，二者差异极显著(P < 0.01)。叶醇在浓度为0.04 mol·L^-1时表现为诱引作用，诱引率为驱避率的1.33倍，二者差异显著(P < 0.05)。R-α-蒎烯、罗勒烯和莰烯的所有测试浓度对雌虫均无明显定向作用。

对于雄虫而言(表 2)，罗勒烯在浓度为0.000 4 mol·L^-1时诱引作用强，诱引率为驱避率的2.67倍，二者差异显著(P < 0.05)。月桂烯在浓度为0.000 4 mol·L^-1时诱引作用强，诱引率为驱避率的2.50倍，二者差异显著(P < 0.05)。莰烯在浓度为0.004 mol·L^-1时驱避作用较强，驱避率为诱引率的4倍，二者差异显著(P < 0.05)；浓度为0.000 4 mol·L^-1时驱避作用最强，驱避率为诱引率的6倍，二者差异极显著(P < 0.01)。叶醇在浓度为0.004 mol·L^-1时表现为诱引作用，诱引率为驱避率的3.33倍，二者差异显著(P < 0.05)。其余5种挥发物所有测试浓度均不能引起雄虫的定向反应。

2.3 鞘蛾幼虫对喷施不同挥发物的苗木的取食反应

幼虫在喷施了活性挥发物样枝上的活动受到很大程度的抑制。喷施挥发物2天后，样枝上的针叶变为暗绿色；3天后，样枝上的幼虫大部分死亡，有的鞘干瘪，头壳外露，从外表明显可见鞘内黑色死亡虫体，有的整个鞘脱落，虫体外露。在存活下来的幼虫中，一部分能够爬行转移到邻近枝条上重新负鞘取食针叶，另一部分挂丝下垂到地面，这些幼虫最终也由于干旱、饥饿而死亡。对照植株上的幼虫发育良好，但大部分都转移到邻近未喷对照液的枝条上，且幼虫能够利用针叶来不断扩大筒鞘，明显可见幼虫利用新鲜针叶结成的绿色筒鞘，并伴随吐丝现象。5天后，喷施对照液及挥发物的针叶均开始出现叶尖变黑，针叶卷曲、萎蔫现象，一周后针叶有脱落现象。因此，本研究幼虫取食试验观察统计了喷施挥发物3天后，幼虫的存活状况(表 3)。

对照落叶松苗上的鞘蛾有86.67%能够转移至邻近未喷挥发物的枝条上进行取食，驱避作用较强，但不至于死亡。而喷施了挥发物的样枝上，均有大量鞘蛾幼虫死亡。方差分析表明：除了月桂烯0.004 mol·L^-1造成幼虫的死亡虫数最少，幼虫校正死亡率为12.28%，与对照差异不显著(P>0.05)以外，其余几种挥发物对鞘蛾幼虫的致死率较对照的差异均达到极显著水平(P < 0.01)。其中，S-α-蒎烯0.04 mol·L^-1造成幼虫的死亡率最高，3-蒈烯0.04 mol·L^-1次之，S-β-蒎烯0.000 4 mol·L^-1造成的幼虫死亡率最低。

3 讨论 3.1 鞘蛾成虫对植物挥发物的EAG反应

寄主植物挥发物对许多蛾类都有电生理活性或行为活性(Coracini et al., 2004；Skiri et al., 2005；Olsson et al., 2006；Masante-Roca et al., 2007)。萜烯类物质是针叶树的主要挥发物成分，很多昆虫都能够对针叶树挥发物成分中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、月桂烯、柠檬烯、β-水芹烯、萜品油烯产生触角电位反应(Pureswaran et al., 2004)。

本研究表明：鞘蛾对寄主植物落叶松挥发物具有明显的EAG反应，且雌、雄虫对同一挥发物成分的敏感程度有所不同，如对于叶醇、S-β-蒎烯、罗勒烯和3-蒈烯的电位反应在雌、雄虫之间差异显著(P < 0.05)；雌、雄虫对同种物质α-蒎烯的R型和S型的电位反应不同，且雌、雄虫对R型α-蒎烯均没有EAG反应，表明，雌、雄虫对寄主化学信息的依赖程度不同，在对寄主化学信息编码过程中，可能只有S型为有效成分，更利于鞘蛾中枢神经系统对寄主化学信息的“质、量”的编码，扩大“信-噪比”，从而使昆虫做出适当的行为选择；雌、雄虫对于S-α-蒎烯和月桂烯的触角电位反应均最强烈，有可能是鞘蛾用来对寄主定向的主要物质。但EAG反应值只能记录昆虫触角电位的总和，究竟是哪种趋向作用还需生物测定来观察。

3.2 鞘蛾成虫对植物挥发物的嗅觉反应

昆虫在与植物长期协同进化的过程中，能够利用植物释放的特异性化合物来寻找寄主，在对寄主的定向和定位过程中，寄主植物挥发物对昆虫产生不同程度的行为影响，甚至对两性昆虫的影响程度也不同(Dormont et al.2001)。

本研究结果可以看出：无论鞘蛾雌虫还是雄虫对R-α-蒎烯均没有表现出明显的趋向反应，这与电生理试验结果相吻合；而其他挥发物在0.4 mol·L^-1时的行为反应与该浓度下的EAG反应结果均有一定出入，这可能是EAG系统本身的局限性造成的(孙凡等，2006)，即由于其只能确定测试剂量，而到达触角的气味分子的剂量不能确定，使得EAG试验的精度受到很大影响，造成EAG反应结果和行为反应结果存在一定偏差。因此，在筛选活性成分时，电生理反应和行为反应应该是相辅相成的，仅仅依赖EAG结果来作出判断是有风险的。

叶醇为本试验中唯一的绿叶挥发物(green leaf volatiles, GLVs)成分，关于GLVs对昆虫的作用说法不一。本研究中，叶醇对鞘蛾雌、雄成虫在一定浓度下均具有明显的诱引作用，有可能是一种有效的诱引剂。

同种昆虫不同性别，对寄主植物挥发物的行为反应有可能不同。本试验观察到：鞘蛾雌虫对寄主植物挥发物的趋向行为反应比雄虫要灵敏，雌虫对6种共10个浓度的挥发物均有趋向反应，而雄虫仅对4种共5个浓度的挥发物有趋向反应，并且只有月桂烯和叶醇为雌、雄虫均能发生反应的。这可能是由于雌虫相对于雄虫而言，更依赖于对寄主植物的有效利用来进行准确定位，而雄虫则更多的依赖于对雌虫释放的性信息素的探测。也有可能雄虫对单个挥发物成分不敏感，而对挥发物的混合物反应强烈，这些都需要以后的进一步试验来验证。

3.3 鞘蛾幼虫对喷施不同挥发物的苗木的取食反应

植物挥发物在昆虫取食过程中起着重要作用(Plepys et al., 2002；Faccoli et al., 2005；Fan et al., 2006)。本试验表明：无论是离体生测中对鞘蛾雌虫有明显诱引作用还是驱避作用的挥发物成分，当把它们分别喷施在活体落叶松苗上时都表现为对鞘蛾幼虫的驱避，甚至致死作用，这可能是因为扰乱了寄主植物的化学指纹图谱，昆虫能够识别这种变化，从而避免取食该植物。

植物挥发物对昆虫的致害作用并不多见，如藏茴香(Carum carvi)、旱芹(Apium graveolens)、茴香(Foeniculum vulgare)、黑胡椒(Zanthoxylum limonella)等植物的挥发油成分柠檬烯、γ-萜品烯、水芹烯等，可作为蚊子幼虫的杀虫剂，有效减少疟疾、登革热等疾病的传播(Pitasawat et al., 2007)。芦子(Piper betle)挥发油对红头丽蝇(Chrysomya megacephala)幼虫有杀虫效果，可开发作为皮肤蝇蛆病的天然药物(Kumarasinghe et al., 2002)。

本研究结果表明：落叶松挥发物对鞘蛾幼虫可能有杀伤作用，其杀伤机理值得深入研究。鞘蛾幼虫取食时，常将头胸部外露爬行，喷施挥发物后幼虫大量死亡，推测挥发物对虫体可能有毒害作用，比如作用于幼虫的化学感受器官或影响虫体发育等。由于本试验是在“接种”幼虫定居后将挥发物直接喷施于植物表面，也可能使幼虫直接浸泡于挥发物溶液而导致死亡，而不是由于幼虫取食了带有挥发物气味的针叶导致死亡。但是值得注意的是，鞘蛾幼虫是潜叶取食叶绿体，并不取食上下表皮，且在取食过程中幼虫始终负鞘，因此，挥发物溶液是否能够渗入针叶内和筒鞘内从而影响幼虫取食和发育并最终导致死亡尚不确定。如此巧妙的取食特点和严格的保护机制也是防治鞘蛾的一大屏障，因此，进一步搞清杀虫机理，将对开发植物源杀虫剂提供一个新的途径。