马拉巴栗(Pachira macrocarpa)，也叫台湾发财树，木棉科(Bombacaceae)瓜栗属。生存于热带雨林地区，原产墨西哥和哥斯达黎加等地，是著名的观叶植物。马拉巴栗种子多胚，1粒种子可发1~3芽，通常播种育苗来繁殖新株。据调查，马拉巴栗种子成熟后不耐保存，1周左右种子活力便急速下降，且该种子也不耐脱水，当脱水至20%时，50%以上的种子会丧失活力，目前未有贮藏马拉巴栗种子的理想方法。本研究以马拉巴栗种子为对象，研究种子脱水耐性的机制，旨在为探索适宜马拉巴栗种子的贮藏方法提供理论依据。

对豌豆(Pisum sativum)(Alscher et al., 2002; Gomez et al., 2004)、白桦(Betula platyphylla)(孙国荣等，2003)、百脉根(Lotus corniculatus)(Borsani et al., 2001)、月季(Rosa hybrida)(单宁伟等，2005)、百合(Lilium)(尹慧等, 2007)、叶底珠(Securinega suffruticosa)(徐兴友等, 2008)的研究发现，失水胁迫会诱导细胞中SOD活性增高，导致SOD同工酶条带发生变化。但迄今为止，有关马拉巴栗种子脱水耐性与SOD同工酶的相关性研究未见报道。因此，本研究拟从SOD活性和同工酶水平上明确马拉巴栗种子失水胁迫耐性与其SOD之间的关联。

1 材料与方法 1.1 材料及处理

2007年8月在深圳市四季青花场，采收因成熟而自然脱落的果实内的种子。种子采收后0.5 h内运回深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院实验室，进行试验。

1.2 方法

将种子分别浸泡于0，5，10，20，30，40，50 mmol·L^-1二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamate, DDTC，SOD专一性抑制剂)(Bailly et al., 2001)溶液中，以室温下放置的种子作对照。在处理中，每10粒种子用100 mL液体浸泡。在室温下以60 r·min^-1的速度振摇吸收12 h。取出后在温度24~26 ℃下置于硅胶干燥器中10 h作脱水处理，种子与硅胶比例为1:5。然后取出测定种子含水量、相对电导率、MDA含量、SOD活性和种子活力指数。并通过这些结果，从中筛选出有效的DDTC预处理浓度；而后以此浓度和清水预处理种子12 h，再分别进行0，3，6，12，20 h的硅胶脱水，测定种子含水量、相对电导率、MDA含量和种子活力指数，并进行SOD同工酶凝胶电泳分析。每试验重复进行3次。

种子出苗率测定方法为每个处理播种50粒种子，10天后统计所有种子成苗的数量；种子活力指数测定参考吕成群等(2000)的方法；种子含水量测定参照杨期和等(2007)的方法；相对电导率和MDA含量参考林植芳等(1984)的方法，稍加改动。电导率用DDS-11A型电导率仪测定，用蒸馏水和去离子水冲洗干净后浸泡于100 mL去离子水中，加盖浸泡过夜后测定电导率R₁，然后转至沸水浴中煮1 h，冷却至室温后测定电导率R₂，按照相对电导率(%)＝R₁/R₂×100%进行计算；MDA含量的测定，用每克材料加入10 mL 5%TCA的比例提取种子MDA，提取液离心后加入0.67%TBA 2 mL，100 ℃水浴中煮沸30 min后，分别测定450，532，600波长下的吸光值，按公式算出MDA含量。

SOD酶活性测定参照Van Breusegem等(1999)的方法稍加改动，以可抑制NBT光还原反应50%的酶量为1个SOD活性单位(1 unit)；同工酶电泳采用不连续的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶垂直板装置电泳，染色采用改良苯胺法(廖兆周，1988)。

2 结果与分析 2.1 DDTC预处理液适宜浓度筛选 2.1.1 对种子萌发率和活力指数的影响

由图 1可知，经过10 h硅胶干燥处理的种子萌发率和活力指数明显下降，且种子活力指数下降幅度更明显。不同处理间种子活力指数的差异显著(图 1B)，种子萌发率和活力指数先迅速下降，后上升，以20 mmol·L^-1DDTC处理的种子萌发率和活力指数最低，萌发率只有36%，比CK下降了64%；活力指数下降至52.06，比CK下降近90%。

2.1.2 对种子相对电导率和MDA含量的影响

从图 2可知，经干燥处理后，种子相对电导率和MDA含量随DDTC浓度升高呈现先增加后降低的趋势，且以20 mmol·L^-1处理为最大值。

2.1.3 对种子SOD活性的影响

从图 3可知，刚采收的新鲜种子SOD活力是281.087 U·g^-1，经DDTC预处理后，除5，10 mmol·L^-1 DDTC处理过的种子的SOD活性有所提高外，其他浓度处理后SOD活性均不同程度下降。与0 mmol·L^-1DDTC处理的种子相比，其他浓度DDTC处理均明显使种子SOD活性受到不同程度的抑制，20 mmol·L^-1 DDTC预处理种子中的SOD活性最低，下降幅度为78.83%。

综上所述，20 mmol·L^-1DDTC预处理比较成功，有效地抑制了成熟马拉巴栗种子的SOD活性，使硅胶干燥后的相对电导率和MDA含量明显增高，种子活力显著下降。因此，选用20 mmol·L^-1DDTC对马拉巴栗种子进行不同干燥程度的研究。

2.2 DDTC预处理对种子脱水后活力的影响 2.2.1 硅胶脱水不同时间下种子含水量的变化

如图 4所示，随着脱水的进行，种子含水量逐步降低。无论是否经过DDTC处理，材料在脱水初期的含水量下降较快，在脱水进行6 h以后，种子含水量的下降速度逐渐减缓。随着脱水的进行，种皮逐渐失去柔软性，变得脆硬，在脱水15 h左右，胚因为较大程度失水萎缩，与种皮明显分离。

2.2.2 脱水对种子活力指数和出苗率的影响

从图 5可以看出，种子的活力指数随着脱水时间的延长而降低。未经DDTC处理的种子脱水3 h后，种子活力指数下降到对照的85.05%，出苗率接近对照水平；经过DDTC处理3 h后，种子活力指数下降明显，为对照的47.09%，出苗率从202%下降到140%；未经DDTC处理的种子脱水20 h，种子活力指数迅速下降到对照的12.54%，出苗率也下降到54%；但是经过DDTC处理的种子，在脱水12 h后，种子活力指数下降到对照的11.98%，脱水20 h，种子活力仅为对照的3.90%，出苗率仅有26%。由此可见，马拉巴栗种子的活力与脱水程度有密切的关系，20 mmol·L^-1DDTC预处理更进一步加剧了脱水对种子的活力指数和出苗情况的影响，整体种子活力急速下降。

2.2.3 脱水对种子相对电导率和MDA含量的影响

从图 6可知，2种处理方式在3~20 h的脱水过程中，种子相对电导率和MDA含量呈现相同的变化趋势，即随脱水程度加重，两者均呈增加趋势，但是，相同的脱水时间，与对照(蒸馏水浸泡后直接脱水)相比，20 mmol·L^-1DDTC预处理进一步加剧了种子相对电导率和MDA含量的增加，而且在脱水6 h后，经DDTC处理的与对照的差异更为明显。脱水6 h时，DDTC预处理的种子相对电导率是对照的298.5%，MDA含量是对照的225.2%，到脱水20 h(此时种子含水量为16.48%)时，DDTC预处理的种子相对电导率是对照的778%，MDA含量是对照的505.1%。

2.2.4 脱水对种子SOD活性的影响

如图 7所示，随着脱水的进行，SOD活性先轻微下降，随后上升，到脱水6 h以后，活性大幅下降。经过20 mmol·L^-1DDTC预处理的种子在脱水20 h后，活性更降低至25.31 U·g^-1。

2.3 DDTC预处理对种子SOD同工酶的影响 2.3.1 马拉巴栗种子SOD同工酶鉴定

基于SOD不同类型同工酶对SDS、H₂O₂和KCN的不同反应，即MnSOD对KCN和H₂O₂都不敏感，但对SDS敏感；FeSOD对H₂O₂敏感，对1%SDS和KCN不敏感；Cu/ZnSOD对KCN和H₂O₂都敏感，但对1%SDS不敏感等特征，对马拉巴栗新鲜的成熟种子中SOD同工酶的类型进行了鉴定(图 8)。

图中B、C、D中的白框分别是凝胶预稳浴液加入KCN、H₂O₂和SDS后被抑制的SOD同工酶种类，根据H₂O₂、KCN和1%SDS对3种同工酶的不同抑制效应，鉴定出种子中MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD这3种类型都存在。其中MnSOD有2种，FeSOD有4种，Cu/ZnSOD有2种；迁移率大小依次是Cu/ZnSOD＞FeSOD＞MnSOD；谱带强弱依次为FeSOD＞Cu/ZnSOD＞MnSOD。

分析种子中各类SOD同工酶相应种类的变化，可发现SOD只是谱带强弱上存在变化。

2.3.2 DDTC预处理对种子SOD同工酶的影响

从图 9可知，与没有经过硅胶脱水的种子相比，经不同时间脱水处理后，种子SOD同工酶条带的亮度大部分都出现了变化，具体表现为：脱水3 h，除了Cu/ZnSOD2的亮度稍降外，8条条带亮度有不同程度的增强，MnSOD2及FeSOD2，FeSOD3，FeSOD4相对明显；脱水6 h，所有条带的亮度开始下降，FeSOD1，FeSOD4和Cu/ZnSOD2变得非常微弱；继续脱水至20 h，除了FeSOD3和Cu/ZnSOD1还留有较清晰条带外，其他条带基本消失。

图 10表明，经过20 mmol·L^-1DDTC低温预处理的样品，与未经预处理的(图 9)相比，种子中各同工酶条带亮度明显降低，特别是FeSOD3的亮度下降最明显；经过脱水处理3~12 h后，除了MnSOD1，FeSOD3，Cu/ZnSOD1还能较清晰看到，其他条带全部消失。脱水至20 h，所有条带都消失。

由此推测，MnSOD，FeSOD1，FeSOD2，FeSOD4和Cu/ZnSOD2是与种子脱水耐性密切相关的条带。

3 讨论

本研究在DDTC浓度筛选基础上，选择20 mmol·L^-1的浓度有效地抑制了马拉巴栗种子SOD活性，使SOD活性从314.08 U·g^-1急剧下降至66.501 U·g^-1，抑制率达到78.83%。同时，20 mmol·L^-1DDTC预处理加重了种子脱水过程中相对电导率、MDA含量的增加，明显降低了种子活力指数、出苗率，显著缩短了种子干燥保存过程中的寿命。上述研究结果证明种子中SOD活性降低后，种子的脱水耐性明显减弱，同时表明马拉巴栗种子脱水耐性伴随有SOD活性变化。通过相关分析显示，马拉巴栗种子含水量和种子萌发率、出苗率呈极显著正相关(r=0.997^**; r=0.987^**); 含水量与种子活力指数也呈显著正相关(r=0.941^*)；马拉巴栗种子萌发率与相对电导率和MDA含量彼此间呈负相关，相对电导率与萌发率之间达到极显著水平(r=-0.977^**)，MDA含量和萌发率之间也达到显著水平(r=-0.955^*)；种子出苗率与MDA含量和相对电导率之间也呈显著负相关(r=-0.916^*；r=-0.948^*)；而活力指数与相对电导率、MDA含量之间虽然未达到显著水平，但相关系数均较高(r=-0.851；r=-0.829)。

从已有报道(Gomez et al., 2004; Borsani et al., 2001; 单宁伟等, 2005)分析，失水胁迫对SOD同工酶的影响因植物种类、胁迫强度等不同而异。例如，营养生长末期的豌豆(Pisum sativum cv. Linclin)苗经轻度盐胁迫后，Cu/ZnSOD增强，MnSOD活性没有变化；重度胁迫后Cu/ZnSODⅡ明显减弱，而FeSOD条带明显增强(Inaki et al., 1998)。百脉根水培苗经2~6 h失水胁迫后，叶片Cu/ZnSOD活性上升，MnSOD活性下降，FeSOD活性没有变化(Borsani et al., 2001)。切花月季Samantha花朵经失水胁迫处理后，诱导产生了3条新的FeSOD(FeSOD4~6)条带，同时MnSOD消失(单宁伟等, 2005)。

本研究表明，马拉巴栗成熟种子中MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD都存在，其中，MnSOD有2种，FeSOD有4种，Cu/ZnSOD有2种。硅胶脱水处理后，只留下FeSOD和Cu/ZnSOD的部分条带(FeSOD3和Cu/ZnSOD1)，其他条带消失，没有诱导产生新的条带。DDTC预处理再进行脱水处理，最后所有条带全部消失。基于上述结果可以初步推测马拉巴栗种子脱水过程中，有SOD同工酶带与活性变化与其相伴随。初步脱水，SOD同工酶条带亮度都明显增强，随着脱水程度加深，SOD同工酶条带亮度降低甚至部分消失，说明脱水过程中，SOD首先被诱导合成，致使其活性增强，脱水至一定程度后，SOD活性下降，这与SOD活性测定结果相吻合。

而经过DDTC预处理，种子中的SOD活性被抑制，加速了种子脱水过程的衰老和死亡。推测，SOD被抑制后，种子内产生的 产生和清除的动态平衡被打破，不断积累的通过一系列氧化还原反应生产了更多的活性氧种类(H₂O₂，OH·，¹O₂等)，诱发了更为严重的氧化胁迫，导致膜脂过氧化，种子生理代谢紊乱，使种子表现出活力和出苗率大幅降低等一系列衰老和死亡症状。