文章信息
- 张晓英, 甘敬, 尹伟伦, 朱祯, 王华芳.
- Zhang Xiaoying, Gan Jing, Yin Weilun, Zhu Zhen, Wang Huafang
- 国槐遗传转化体系的优化
- An effective Transformation System of Sophora japonica
- 林业科学, 2009, 45(5): 20-26.
- Scientia Silvae Sinicae, 2009, 45(5): 20-26.
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文章历史
- 收稿日期:2008-12-23
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4. Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences Beijing 100101
国槐(Sophora japonica),豆科(Leguminosae)槐树属植物,原产中国北方(陈嵘,1957),是一种集药用、食用、材用、观赏于一体的优良树种,全国各地均有栽培。在北京,存在百年以上的国槐数量最多,这些古槐见证着北京悠久的历史。但是长期以来国槐遭受虫害较为严重,初步统计有14种以上(弗林特等,1985),危害较大的有槐尺蠖(Semiothisa cinerearia)、蚜虫(Aphis medicaginis)等。虫害威胁国槐的生存生长,同时也影响城市景观。目前在国槐的栽植中,均需施用化学杀虫剂进行防治,不仅对人、畜、树木的正常生长构成威胁,而且造成了严重的虫-药双重环境污染。
随着植物生物技术的不断发展,通过基因工程手段导入外源抗虫基因从而培育出国槐抗虫新品系将成为可能。自从Parsons等(1986)证实了杨树可以进行遗传转化并且外源基因能在林木细胞中表达,随后的林木基因工程研究取得很大进展。现已对杨树(Populus)、松树(Pinus)、桉树(Eucalyptus)、核桃(Juglans regia)等20多个树种进行了转化研究,其中大部分已获得了转基因植株(王关林等,2002)。但是,由于国槐遗传转化过程中涉及的影响因子诸多,侵染后外植体不易分化,有关国槐抗虫转基因的研究迄今未见报道。本文在前期多次预试验探索的基础上研究影响国槐转化频率的各项因素,优化其转化系统,以便进一步利用基因工程手段对国槐进行抗虫性遗传改良。
1 材料与方法 1.1 植物材料所用国槐无菌苗取自北京林业大学植物生物技术学科实验室,由国槐种子萌发后,在附加6-BA 1.0 mg·L-1和IAA 0.1 mg·L-1的MS(Murashige et al., 1962)培养基上进一步继代繁殖得到,苗高均为1.0 cm以上。
1.2 质粒与菌株含有修饰的cpti基因的植物表达载体pBinΩSCK由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101携带,菌株和质粒pBinΩSCK由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯实验室构建并惠赠。所含标记基因为npt Ⅱ(新霉素磷酸转移酶基因),npt Ⅱ和经过修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因分别受花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子控制,其T-DNA区段基因结构见图 1。
取出用于转染的农杆菌菌种,在含有卡那霉素(Km,50 mg·L-1)与利福平(Rif,50 mg·L-1)2种抗生素的平板(YEB培养基)上划线,置于27 ℃恒温箱内培养,至长出单菌落后挑取单菌落,接种于含相应抗生素的液体YEB培养基,于27 ℃恒温下摇床培养(200 r·min-1)过夜。
1.4 叶盘法转化国槐取生长健壮的无菌苗叶片416枚,放在预培养培养基上预培养2~3天。用叶盘法(Horsch et al.,1985)将预培养的无菌叶片,在菌液中浸染10~15 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。
叶片预培养培养基配方:MS+6-BA 3.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1;叶片共培养培养基配方:MS+6-BA 3.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+AS 100 μmol·L-1;叶片分化筛选培养基配方:MS+6-BA 3.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+G418 8 mg·L-1+Cef 500 mg·L-1;生根筛选培养基:1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1+G418 10 mg·L-1+Cef 200 mg·L-1。
1.5 影响根癌农杆菌转化频率的因素取生长健壮的无菌苗叶片,经过侵染后筛选抗性植株。试验分别从影响转化效果的7个关键因子入手,以期在能得到抗性表达植株的基础上改进各个转化因子,得到一个高效、稳定的转化系统。
1.5.1 预培养时间侵染前将叶片分别在培养基MS+6-BA0.5 mg·L-1+IAA0.05 mg·L-1上预培养0,3,4,5,6,7天,将预培养的无菌叶片,在菌液中浸染10~15 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25?℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。观察不同的预培养时间对转化频率的影响。
1.5.2 菌液浓度在OD600值分别为0.3,0.5,0.7,0.9,1.2的菌液中侵染10 min,用无菌滤纸吸干后,分别转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。观察不同的菌液浓度对转化频率的影响。
1.5.3 农杆菌菌株使用BIO-RAD公司的电激仪将植物表达载体pBinΩSCK导入根癌农杆菌LBA4404,GV3101,EHA105中,具体方法按照产品说明书进行。将国槐无菌苗叶片,分别浸入活化好的3种菌液中浸染10~15 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,分别转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。观察不同的农杆菌菌株对转化频率的影响。
1.5.4 侵染时间在OD600为0.7的菌液中侵染2,5,10,15,20 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,分别转入共培养培养基中于25 ℃暗培养2~3天后,最后将叶片转入分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。观察不同的侵染时间对转化频率的影响。
1.5.5 乙酰丁香酮1) 在根癌农杆菌培养过程中,用来侵染的菌液中,观察加入500 μmol·L-1乙酰丁香酮(3,5-dimethoxy-4-hydro xyaceto phenone,AS)和不加乙酰丁香酮对转化频率的影响;2)在共培养过程中,观察共培养培养基中加入200 μmol·L-1乙酰丁香酮和不加乙酰丁香酮对转化频率的影响。
1.5.6 共培养时间叶片侵染完后分别共培养1,2,3,4,5天,将叶片分别转入分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根,观察不同的共培养时间对转化频率的影响。
1.5.7 脱菌培养国槐叶片共培养3天后,分别转接到附加头孢霉素(cefotaxine,Cef)和羧苄青霉素(carbenicillin,Carb)不同浓度(0, 300, 400, 500和600 mg·L-1)的筛选培养基上进行培养,56天后观察分化情况并统计愈伤组织的诱导情况。
1.5.8 优化后转化频率的比较取生长健壮的无菌苗叶片427枚,放在预培养培养基上预培养5天。用叶盘法将预培养的无菌叶片,在添加200 μmol·L-1乙酰丁香酮且OD600为0.7的菌液中浸染10 min左右,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入同样含200 μmol·L-1乙酰丁香酮的共培养培养基中于25 ℃暗培养3天后,最后将叶片转入含头孢霉素的分化筛选培养基中,25 ℃的光条件下培养。继代选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生根。同时,选择未经侵染的116枚无菌叶片,培养程序同上。
1.6 转基因植株的PCR检测采用CTAB法(Porebski et al.,1997)提取5株转基因植株DNA,以pBinΩSCK为阳性对照,以未转化植株叶片DNA为阴性对照,参照sck基因全长设计引物:5′端为5′AAAATGAAGAGCACCATCTTC3′;3′端为5′TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATC3′。
在25 μL总反应体系中加入基因组总DNA各0.1 g为模板,引物浓度均为0.4 pmol,dNTP各200 μmoL,Taq聚合酶1 U。反应程序为95 ℃预变性5 min,后94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,36个循环后在72 ℃继续延伸10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7 转基因植株的Southern杂交检测用HindⅢ酶切质粒pBinΩSCK,从凝胶中回收约415 bp的sck基因片断为模板,采用随机引物法(α-32P)dCTP(10 μCi·μL-1)1 μL放射标记探针。将PCR检测阳性的植株DNA样品进一步纯化,每份样品取10 μg用HindⅢ酶切约16 h后进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶浓度为1%,35 V电泳约15 h,以真空电转移法将DNA转移至Hiband N+尼龙膜上。用sck基因全长片段作为探针α-32P标记后65 ℃杂交过夜。于-70 ℃放射自显影7天,冲洗X光片并照相记录结果。
2 结果与分析 2.1 各因子对转化频率的影响 2.1.1 不同预培养时间对转化频率的影响国槐的叶片富含蛋白质,叶质较嫩,预培养对国槐叶片分化是有益的,可以减少伤害胁迫,调整细胞生理状况,从而有利于农杆菌的感染;同时可以减轻经农杆菌侵染后的腐烂褐化(Metz et al., 1995)。从试验设置的对照结果(表 1)表明,不进行预培养,直接用农杆菌感染的叶片再生抗性芽的频率为0,预培养3天的转化频率为2.4%,显著高于未经过预培养的叶片。当预培养5天时,叶柄已开始呈现愈伤化,此时的外植体经筛选培养,获得的抗性芽的数量最多,转化频率为14.3%。预培养6~7天后,转化频率会降低到7.1%。这表明预培养时间的适当延长使得国槐叶片承受农杆菌侵染的能力大大增强,但是过长时间的预培养会增加假阳性植株,加大后期筛选工作量。
由表 2可知,菌液浓度对转化频率的影响很大,当菌液浓度OD600为0.3时,国槐转化频率仅为6.3%,当OD600值增加至0.7时,转化频率达到最高,为12.9%;当OD600值增加至1.2时,转化频率随之降低,这说明菌液浓度过高或侵染时间过长,常导致农杆菌繁殖过度,对植物材料造成毒害作用,导致外植体褐死,降低转化效率。菌液浓度太低或浸泡时间太短,接种到伤口面的农杆菌数量太少,在共培养时转化效率低。侵染时间对转化频率的影响同样重要,当侵染2~5 min时,获得的抗性芽较少;当侵染时间延长至10 min时,抗性芽产生的频率最高,为10.7%;侵染20 min时,几乎所有外植体在培养过程中褐死,很难获得抗性芽。这表明国槐叶片比较脆弱,对外界影响极为敏感,不适条件的处理会极大地降低其再生频率,因此建立适宜的农杆菌侵染方法是成功转化的重要前提。
3种菌株LBA4404,EHA105,GV3101分别作为质粒pBinΩSCK的载体用于转化国槐叶片,在添加抗生素的培养基上筛选培养8周后统计转化效率(表 3)。结果表明,农杆菌GV3101介导的转化率达到19.0%,EHA105的转化效率为中等,而LBA4404在转化中表现的毒性较强,农杆菌的生长较难抑制,在很大程度上影响了国槐叶片愈伤组织的形成和分化,其转化率仅为8.33%。转化效率依次为GV3101>EHA105>LBA4404,说明农杆菌不同菌株对国槐转化效率有明显影响。
农杆菌T-DNA区的加工、转移及整合进植物基因组,主要由Ti质粒上的vir基因编码的功能蛋白完成(James et al., 1993)。因此,农杆菌vir基因的表达及其表达水平直接影响到转化效率。而酚类化合物,如乙酰丁香酮(AS)等,诱导Ti质粒vir基因的表达,进而引起T-DNA的转移(Stachel et al., 1986)。本试验采用附加乙酰丁香酮研究其对国槐叶片转化频率的影响,结果(表 4)表明:国槐叶片在侵染前的菌液和共培养培养基中附加200 μmol·L-1乙酰丁香酮,能够提高转化频率。
共培养时间的长短,直接影响到目的基因的整合及转化细胞的数量,从而影响转化频率。试验结果(表 5)表明,培养1~3天对叶盘褐化影响不大,而对抗性芽的获得影响很大,共培养3天所获得的转化频率是共培养1天的5倍多。虽然,随共培养时间延长,出芽外植体的数目增多,但是大多在筛选过程中变黄、变白,最后死亡;共培养时间较短的情况下,大多数为Kanr芽,假阳性个体较少。试验中还发现,共培养时间越长,叶盘表面农杆菌繁殖越多,筛选培养时农杆菌越难被抑制,故共培养时间以3天为宜。
在用农杆菌转化植物细胞时,常用头孢霉素(cefotaxine,Cef)和羧苄青霉素(carbenicillin,Carb)控制农杆菌的过量生长。由表 6可知,Cef浓度过低,不能完全控制农杆菌生长,从而不能有效地得到抗性愈伤组织;当浓度为500 mg·L-1时,对农杆菌的抑制最明显,外植体死亡率最低,为27.4%,愈伤组织的诱导率最高,为20.5%;浓度再增加则易于引起伤口细胞褐化死亡,抑制愈伤组织的诱导。而Carb 500 mg·L-1时,死亡率虽然也是最低,为24.4%,且比Cef的死亡率还要低,但此时愈伤组织的诱导率较低,为12.3%。充分考虑到各种因素,国槐转化时选择头孢霉素作为抑菌剂,浓度为500 mg·L-1。随继代培养次数的增加,农杆菌逐渐死亡,所用头孢霉素浓度也可逐渐降低至300 mg·L-1。
在对影响国槐转化效果的诸多因素进行优化研究后,建立了一套国槐遗传转化体系:以预培养3天的国槐叶片为外植体,与OD600值为0.7的农杆菌菌液侵染10 min,在pH值为5.0的共培养基中暗培养3天(图版Ⅰ-1)后,经过筛选诱导(图版Ⅰ-3)、伸长(图版Ⅰ-4,5)以及生根(图版Ⅰ-6)等过程,获得抗性植株(图版Ⅰ-8,9),对照植株逐渐死亡(图版Ⅰ-2,7)。通过重复试验得出国槐转化频率平均可达到21.3%(表 7)。由此证明本研究建立的农杆菌转化系统是稳定而相对高效的。
从抗性植株提取植物基因组DNA,以质粒pBinΩSCK作为阳性对照,以未转基因植株作为阴性对照,进行PCR扩增。电泳检测结果如图 2所示。未转化植株基因组未出现PCR扩增片段,转基因的植株经PCR扩增,得到1条和预期长度一样大小的415bp的片段。
分别从PCR检测为阳性的国槐转基因植株中随机选择10株,用HindⅢ酶切植物总DNA,sck基因片段作探针,进行Southern blotting杂交分析,结果表明7株获得了明显的杂交信号,而非转化对照基因组中未出现任何杂交信号(图 3),进而证实了sck基因已整合进国槐的基因组中。从转基因植株Southern blotting的杂交图谱上看,样品5,7和10未出现信号,被确定为假阳性植株,其他都显示了较强的杂交信号,进而证实了sck基因已整合进国槐的基因组中。
外植体在用农杆菌接种之前是否需要进行预培养,文献中的结果不一致。一般认为预培养使植物组织代谢活跃,可促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,因而提高外源基因的短暂表达和稳定整合率,同时可以减轻农杆菌所导致的腐烂褐化(王瑶等,1999;Metz et al., 1995)。本文试验也证实了这一结论。外植体的预培养时间与其频率有明显关系,每一种外植体均有其最佳预培养时间。预培养时间太长降低外植体的转化率,一般以2~3天为宜,例如矮牵牛(Petunia hybrida)、番茄(Lycopersicum esculentum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica campestris)等的转化中均需2天预培养(Stachel et al., 1986)。但是,由于本文研究中侵染的受体材料来自试管苗,叶片较幼嫩,对农杆菌的承受能力较差,因此,得出的结果是预培养5天的效果较佳。但在植物基因工程中,也有相反的结果,有的植物预培养无作用,如烟草(Nicotiana tabacum)、豇豆(Vigna unguiculata)和苜蓿(Medicago sativa)叶片均不需要预培养,甚至还有的植物经预培养反而会降低转化率,如树番茄(Cyphomandra betacea)、猕猴桃(Actinidia chinensis)(Bolton et al., 1986)等。总之,是否需要预培养,预培养多长时间,要根据不同植物、不同外植体、不同植物种和不同培养系统而定。
菌液浓度和侵染时间对转化频率的影响很大,其他植物的转化试验也研究了二者对转化频率的影响(吴关庭等,2005;高莉萍等,2005),本试验结果与此一致。菌液浓度过高或浸泡时间过长,常导致农杆菌繁殖过度,对植物材料造成毒害作用,导致外植体褐死,很难得到抗性芽;菌液浓度太低或浸泡时间太短,接种到伤口面的农杆菌数量太少,在共培养时转化效率低。因此建立适宜的农杆菌侵染方法是成功转化的重要前提。
不同木本植物与农杆菌的相互作用各有差异,如苹果(Malus pumila)上EHA101优于LBA4404、C58C1(Bondt et al., 1994);杨树(Populus)上C58优于LBA4404(Feuillet et al., 1995)。因此在植物转化中应视不同树种选择有效的农杆菌菌株。
农杆菌T-DNA区的加工、转移及整合进植物基因组,主要由Ti质粒上的vir基因编码的功能蛋白完成。因此,农杆菌vir基因的表达及其表达水平直接影响到转化效率。植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对农杆菌基因的表达有诱导作用(Bolton et al., 1986;James et al., 1990)。本试验结果表明:在国槐的基因转化中,酚类物质的添加至关重要。这与前人在苹果、杨树等木本植物中的研究结果相一致(James et al., 1993;Godwin et al., 1991;Owens et al., 1988;Stachel et al., 1986;Bolton et al., 1986;Petri et al., 2004)。但也有研究认为,在菌液中加入乙酰丁香酮不能提高转化频率(Confalonieri et al., 1995;Zhang et al., 2000)。
外植体与根癌农杆菌共培养是获得转化体的主要途径。在共培养阶段,携带有目的基因的T-DNA在农杆菌体内完成加工,向植物细胞转移,从而整合进植物基因组(Stachel et al., 1986)。因此,共培养时间的长短,直接影响到目的基因的整合及转化细胞的数量,从而影响转化频率。
结束共培养的外植体表面及浅层组织中,存在大量农杆菌,为获得健康的再生植株,常用头孢霉素和羧苄青霉素控制农杆菌的过量生长,而且二者除抑制农杆菌生长外,还影响植物的生长发育。Joersbo等(1996)报道,头孢霉素促进生根,抑制芽的分化;而羧苄青霉素则促进芽分化,抑制生根。因此根据不同材料在不同生长阶段应附加不同的抑菌剂。
建立高效稳定的组织培养再生系统是用农杆菌侵染植物细胞获得转基因植株的重要前提。本试验在探索国槐高效再生体系的研究中,其再生频率可达80%以上;但经农杆菌侵染后,再生频率最高只有21.3%。这表明国槐外植体非常脆弱,不适条件的影响会极大地降低其再生频率,因此国槐更完善更高效的遗传转化体系的建立尚需进一步研究。
陈嵘. 1957. 中国树木分类学. 北京: 科学出版社.
|
弗林特M L, 范德博希R. 1985. 害虫综合治理导论. 北京: 科学出版社.
|
高莉萍, 包满珠. 2005. 优化农杆菌介导的月季转化体系. 北京林业大学学报, 27(4): 60-64. |
王关林, 方宏筠. 2002. 植物基因工程. 北京: 科学出版社.
|
王瑶, 林木兰. 1999. 农杆菌介导的木本植物转基因. 生物技术通讯, 16(6): 23-27. |
吴关庭, 胡张华, 郎春秀, 等. 2005. 农杆菌介导高羊茅转化体系的建立. 核农学报, 19(5): 340-346. DOI:10.3969/j.issn.1000-8551.2005.05.004 |
Bolton G W, Nester E W, Gordon M P. 1986. Plant phenolic compounds induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science, 232: 983-985. DOI:10.1126/science.3085219 |
Bondt A D, Eggermont K, Druart P, et al. 1994. Agrobacterium-mediated transformation of apple and assessment of factors affecting in gene transfer efficiency during early transformation steps. Plant Cell Rep, 13: 587-593. DOI:10.1007/BF00234517 |
Confalonieri M, Balestrazzi A, Bisoffi S. 1995. Factors affecting Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in several black poplar clones. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 43: 215-222. |
Feuillet C, Lauvergeat V, Deswarte C, et al. 1995. Tissue and cell specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Mol Bio, 27: 651-667. DOI:10.1007/BF00020220 |
Godwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, et al. 1991. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports, 9: 671-675. DOI:10.1007/BF00235354 |
Horsch R B, Fry J E, Hoffman N L, et al. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science, 227: 1229-1233. DOI:10.1126/science.227.4691.1229 |
James D J, Passey A J, Babara J. 1990. Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) using disarmed binary vectors. Plant Sci, 69: 79-94. DOI:10.1016/0168-9452(90)90106-X |
James D J, Uratsu S, Cheng J, et al. 1993. Acetosyringone and osmoprotectants like betaine or proline synergistically enhance Agrobacterium-mediated transformation of apple. Plant Cell Rep, 12: 559-563. |
Joersbo M, Okkels F T. 1996. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection. Plant Cell Rep, 16: 219-221. DOI:10.1007/BF01890871 |
Metz T D, Dixit R, Earle E D. 1995. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage(B. oleracea var. capitata). Plant Cell Rep, 15: 287-292. DOI:10.1007/BF00193738 |
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant, 15: 473-497. DOI:10.1111/ppl.1962.15.issue-3 |
Owens L D, Smigocki A C. 1988. Transformation of soybean cells using mixed strains of Agrobacterium tumefaciens and phenolic compounds. Plant Physiology, 88: 570-573. DOI:10.1104/pp.88.3.570 |
Parsons T J, Sinkar V P, Stettler R F, et al. 1986. Transformation of poplar by Agrobacterium tumefaciens. Bio-Technology, 4(6): 533-536. |
Petri C, Alburquerque N, Garcia-Castillo S. 2004. Factors affecting gene transfer efficiency to apricot leaves during early Agrobacterium-mediated transformation steps. Hortic Sic Biotech, 79: 704-712. DOI:10.1080/14620316.2004.11511830 |
Porebski S, Bailey G, Baum B R. 1997. Modification of CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 15: 8-15. DOI:10.1007/BF02772108 |
Stachel S E, Zambryski P C. 1986. VirA and virG control the plant-induced activation of the T-DNA transfer process of A. tumefaciens. Cell, 46: 325-333. |
Stachel S E, Messens E, Montagu V, et al. 1986. Indentification of the signal molecules produced by wounded plant cells that active T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature, 318: 624-629. |
Zhang F L, Takahata Y, Watanabe M, et al. 2000. Agrobacterium-mediated transformation of cotyledonary explants of Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis). Plant Cell Rep, 19: 569-575. DOI:10.1007/s002990050775 |