生物防治是目前有害生物防治研究的热点之一，它具有无污染、无毒害、费用低廉的特点，其应用前景十分广阔。生物除草是有害生物综合治理和保护生态环境的一个重要内容，许多国家都致力于这方面的研究，它主要是利用真菌微生物的孢子或有害代谢产物(毒素)的致病性，达到防除杂草的目的(TeBeest et al., 1992；Zhang et al，1997a；1997b；Scheepens，1987；强胜，1997；丁建清，1995)。总体上，微生物除草剂的研究、开发比微生物杀虫剂、杀菌剂起步晚，但发展迅速，至今已有“鲁保一号”(高昭远等，1992)、“Collego”等8个真菌性生物除草剂商品化或在实践中大量使用，随着各国政府对环境和农业可持续发展的重视，民众对自身健康的关注，对绿色甚至有机食品的需求，将导致在农、林业上减少甚至禁止使用化学农药，从而为微生物除草剂的研究、开发及利用留下广阔空间。因此，开发环保型的生物农药，符合国际有害生物综合治理的发展趋势，必将创造巨大的经济和社会效益。本文以枯斑盘多毛孢菌(Pestalotia funerea)为对象，通过自然选育和诱变育种筛选出对林业苗圃中的菟丝子(Cuscuta chinensis)、列当(Orobanche coerulesens)、空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)有强毒力的菌株。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 参试菌株

枯斑盘多毛孢菌共35个，由笔者于1999年至2001年在四川各地不同松类寄主植物(松赤枯病)分离纯化而得，寄生树种及生态环境(海拔)见表 1。

1.1.2 杂草

林业苗圃地中的菟丝子、列当、空心莲子草，其中参试菟丝子、列当为在苗圃地与寄主苗木寄生后的“菟丝子+山茶(Camellia japonica)”、“列当+桤木(Alnus cremastogyne)”(试验时移植到花盆中)。

1.2 方法 1.2.1 生物除草剂原型菌株毒力比较

以PD培养基为基础培养基，以Ф 7 mm/100 mL的量定量接种在PDA平板上培养的枯斑拟盘多毛孢菌菌丝块，于25 ℃下静置培养27天。先用双层纱布滤去菌丝体，再用双层滤纸过滤即得液体代谢物。用喷雾器将液体代谢物均匀喷洒于盆栽(“菟丝子+山茶”、“列当+桤木”寄生体)的上述寄生性种子植物、空心莲子草上至叶湿润刚好有水珠滴下为止，生测条件为：22 ℃，每天光照12 h，以不接菌的PD培养液为对照，重复3次(30株杂草为1重复)。逐日观察叶片(菟丝子、列当为退化鳞状叶片)的变化，比较不同来源菌株对寄生性种子植物和杂草的毒力。

1.2.2 物理诱变选育生物除草剂菌株

吸取枯斑盘多毛孢(P11)菌液(PDA平板培养产孢后用无菌水洗出的含孢液体)作适当稀释(2×10⁴)后，取5 mL菌液，置于灭菌培养皿中，先用紫外灯照射1 min，再打开皿盖，设置照射时间1，2，3，4，5 min(15 W紫外灯，距离20 cm)，求出亚致死剂量(99%死亡率)，在此条件下经3次诱变(注意应在红光下进行，避免光回突变)，获得10株诱变生物型，经培养、过滤、生测后，采用朱天辉(2003)方法纯化各菌株代谢产物，并比较其毒力，参照上述自然选育方法，用纯物质测定其防除能力，对新增代谢产物纯物质用质谱、红外光谱、核磁共振(朱天辉等，2005)测定其分子结构。

2 结果与分析 2.1 不同来源的枯斑盘多毛孢对寄生性种子植物和杂草的毒力比较

以列当、菟丝子、空心莲子草为对象测定不同来源枯斑盘多毛孢毒力的结果如表 1所示。在35个菌株中，按树种类型分析，油松上菌株的毒力总体强于马尾松(Pinus massoniana)，以油松(Pinus tabulaeformis)上的PF-11毒力最强，马尾松上的菌株(PF-2)次之，因此，把PF-11，PF-2作为自然选育的2个高毒力生物除草剂的原型菌株(以下仅用PF-11为出发菌株进行诱变选育)，同时，研究发现2种寄生性种子植物和空心莲子草对2菌株毒素的反应也有差异，列当呈黑色伤斑，菟丝子、空心莲子草为红色伤害。

2.2 诱变生物型代谢产物的变化

用硅胶H60型作柱层析的填料，正丁醇:水:甲醇(4:2:1)作洗脱剂进行柱层析时，这种体系能将诱变菌株代谢产物明显地分为9个黄色深浅不一的色带，按色带收集并在256 nm处测定各色带的吸光度。绘制分离色谱图，出发菌株P11可收集到8个分离物，诱变菌株可得到9个分离物(图 1)。

将各色带洗脱液(9瓶)于40 ℃下抽真空旋转蒸干后，用适量蒸馏水溶解并用待测材料测其生物活性，结果表明：P11菌株瓶号为3，5，6的洗脱液样品有致病活性(表 2)，将上述3个样品分别反复柱层析，并用薄层层析检测纯度(每个样品仅为一个Rf)，最后完全纯化的3号样品(活性组分Ⅰ)、5号样品(活性组分Ⅱ)、6号样品(活性组分Ⅲ)的Rf分别为0.83，0.79，0.80；诱变菌株P11-4瓶号为3，5，6，8的洗脱液样品有致病活性，纯化后的Rf分别为0.83，0.79，0.80，0.60，表明诱变后增加了一种活性物质(表 3)，通过红外光谱、质谱、核磁共振测定该物质为一植物含氮多糖：EI⁺MS给出的提示分子量为326，红外光谱图显示在3 381 cm^-1处有一特征峰出现，说明其内可能含有—OH，—NH₂存在；在2 928 cm^-1处有特征峰出现，说明其内有CH存在；在1 607 cm^-1处有特征峰出现，说明其内有N—H存在；在1 418 cm^-1处有特征峰出现说明其内有—OH存在；在1 031 cm^-1处有特征峰存在说明其内有C—O—C存在。¹HNMR谱中给出的质子信号为δ4.7~5.0(OH)，δ3.0~4.1(推断该物质为糖类)，δ2.41，δ4.6说明其内有—CH₃基团，结合以上结果可以推测出该化合物为糖类，其分子式为C₁₂H₂₃O₉N(M_r=325)，分子结构式为。

2.3 诱变生物型对寄生性种子植物和杂草的毒力

以PF11为出发菌株，在亚致死诱变剂量条件下经3次连续诱变获得10株抗紫外线的生物型，其代谢产物对寄生性种子植物和杂草的效价如表 4所示。其中3株(PF11-1，PF11-3，PF11-5)为负突变，对目标杂草无毒力；5菌株(PF11-7，PF11-8，PF11-9，PF11-10)毒力未明显增强，只有PF11-4，PF11-6为正突变，对杂草的毒力显著提高。

3 讨论与结论

一般情况下，自然选育获得的菌株很难满足生产需要，如通过物理、化学诱变因素有机会获得“强毒力”菌株，但诱变育种为不定向性，随机性较大，往往负突变机率更大。本研究从来自不同树种、不同地理位置的35个枯斑盘多毛孢中自然选育出2个对寄生性种子植物和杂草有较高毒力的菌株，在此基础上经紫外线连续3次诱变获得了2株正突变抗紫外线生物型(PF11-4，PF11-6)，对寄生性种子植物和杂草有显著的致病作用，有望成为生物除草剂的原型菌株，毒力增强的原因与增加一种植物含氮多糖有关。

一般来说，真菌除草剂是活的植物病原真菌制剂(Jamil，1987；Goto，1992；Tsukamoto，1977；Zhang et al., 1996；王之越等，1985；陈勇等，1999；黄世文等，2001)，在某种程度上类似化学除草剂。生物除草剂的应用是基于植物病理学的流行原理。靶标杂草病害的发生、发展是寄主、病原菌和环境相互影响的结果，病害能否发生、流行可能受很多因素的限制。本研究是利用真菌代谢产物来素毒杀寄生性种子植物和杂草，与传统生物除草机制有一些差异，其除草性质为生物或化学因子有待进一步研究。