桑天牛(Apriona germari)是一种危害严重的蛀干害虫，对我国林业、果树和蚕桑业造成很大威胁(黄大庄，1999)。目前对桑天牛的治理尚无上佳对策。近年来，生物防治桑天牛以其特有的优势受到广泛关注。白僵菌(Beauviera bassiana)是桑天牛最重要的病原微生物之一；但目前对白僵菌的研究还仅限于室内毒性测定和初步野外防治试验，而有关白僵菌对天牛致病机制的研究尚不多。

昆虫不像高等脊椎动物，它们既无T细胞和淋巴细胞，也无免疫球蛋白及完善的补偿系统，但在长期进化过程中，它们产生了独特的免疫系统及防御机制，通过其结构和生理屏障及多种功能的血细胞及其体液免疫因子的协调作用，对侵入虫体的病原体及异物进行免疫防御。昆虫的表皮和前后肠的内膜是抵御外物侵入体内的一种屏障。病原物打破寄主表皮屏障进入到昆虫体内后，还需具有在寄主血腔内进一步增殖的能力。血淋巴是昆虫循环系统的主要组成部分，大量研究已经证实，血细胞能够对入侵微生物做出相应的防御反应，成为病原菌入侵过程中的另一道屏障(时连根等，2001；陆龙喜等，2001；Hung et al., 1993；翟锦彬等，1996；Mazet et al., 1994)；外源微生物能否成功在寄主昆虫体内定殖，一定程度上取决于寄主血细胞的防御能力。目前还没有桑天牛幼虫血细胞对球孢白僵菌防御反应的相关报道。因此本文对球孢白僵菌侵入后桑天牛幼虫血细胞数量及其防御反应进行观察，以期进一步明确白僵菌对桑天牛的致病机制，从而指导桑天牛的防治。

1 材料与方法 1.1 供试昆虫

在河北省保定市采集桑天牛成虫，利用1~2年生幼嫩桑枝进行室内饲养。产卵后10天左右，将孵化出的桑天牛幼虫人工接种到河北农业大学标本园内的毛白杨(Populus tomentosa)枝条中，以见蛀屑和虫粪排出确认成活，2个月后用于试验。

1.2 白僵菌感染方法

将斜面培养的球孢白僵菌Bb00分生孢子配制成2.2×10⁸个·mL^-1悬浮液，取出毛白杨枝条中已发育30天的幼虫，在孢子悬浮液中浸泡1 min，然后再接种入毛白杨枝条中饲养。分别在接种后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5天进行观察。对照组幼虫不作任何处理。

1.3 血细胞总数(THC)的变化

分别在接种后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5和5天的虫体稍前部用解剖针扎小口，血淋巴从伤口溢出成小水珠状，用微量进样器吸取收集血淋巴，将幼虫血淋巴移入适当倍数的血细胞稀释液(2%醋酸与1%次甲基蓝的体积比为100:1)中染色，尽快置光学显微镜下观察，用血球计数器计算血细胞的总数。每种样品重复3次。

1.4 血细胞的形态观察

桑天牛接种白僵菌分生孢子后，定时取血，在Olympus显微镜下观察血细胞吞噬、囊包白僵菌分生孢子的状况并照相。

2 结果与分析 2.1 血细胞数量与组成变化

通过试验观察到，接种白僵菌分生孢子对桑天牛幼虫血细胞数量有显著影响，对照桑天牛幼虫的血细胞种类和数量基本稳定；而被白僵菌感染后的桑天牛幼虫血细胞种类和数量发生变化，变化情况见图 1，2，3和4。

由图 1，2和3可以看出，接种第1天，感染昆虫血细胞总数与对照差异不大；1天后，接种虫血细胞总数逐渐上升，显著高于对照，到第2.5天达最高值。接种第2.5天后处理虫的血细胞总数开始下降，并持续降至较低水平。观察中还发现，被感染虫体血淋巴中的浆血细胞和粒血细胞也表现出类似的规律，在第2.5天左右，其细胞数也达到最大，之后缓慢下降。但下降的速度有所不同，其中，粒血细胞在2.5~3天之间下降迅速，之后较缓慢；而浆血细胞在2.5~3天之间下降较缓，之后出现一迅速下降区，4天以后粒血细胞和浆血细胞数量均趋于稳定。

上述血细胞数量变化动态与白僵菌对桑天牛幼虫的侵染进程是一致的，接种1天前，是白僵菌向寄主表皮入侵的时期，进入到血腔内的菌体极少，血细胞尚未产生明显反应。1天后大量菌体进入血腔内，集中在各器官表面的血细胞在外来物的刺激下开始游离到血淋巴中，致使血细胞数量上升。2.5天以后，随着菌体在寄主体内的增殖，大量血细胞参与到对菌体的免疫反应中，出现血细胞凝聚、围歼、形成结节和囊状体等一系列行为反应，从而消耗了大量血细胞，导致血细胞数量下降。

此外，比较对照组和感染组中浆血细胞和粒血细胞以及其他类型血细胞的变化可以看出(图 4)，其他类型血细胞虽有变化但一直处于较低水平，所以可以说血细胞总数的变化主要是由浆血细胞和粒血细胞的数量变化引起的。对白僵菌的免疫反应过程中，浆血细胞在早期的防御反应中较粒血细胞更活跃，而在后期则是浆血细胞和粒血细胞共同作用的结果。

2.2 接种白僵菌后桑天牛幼虫血细胞的防御反应

接种白僵菌分生孢子1天，就观察到血腔内出现少量细小的菌丝段(图 5a)，说明已有分生孢子侵入虫体，随后菌丝段数量有所增加，血细胞开始出现免疫反应，可观察到菌丝段粘附于血细胞表面，一个血细胞上粘附有一个或多个菌丝段(图 5b, c)。

还可见血细胞表面伸出伪足样突起(图 6a)，许多血细胞聚集在一起形成大量细胞结节(图 6b, c)；随后结节数量逐渐增多、体积增大，结构变得紧密。

接种白僵菌分生孢子1.5天后，可观察到吞噬了虫菌体和菌丝段的血细胞(图 7a, b)，血细胞周围出现一圈空泡(图 7c)。其中，少量血细胞体积膨大，里面充满虫菌体和细小菌丝。

血淋巴中可以见到部分黑化的组织残片及虫菌体。随后出现大量黑化血细胞、组织残片、虫菌体等(图 8a)，此时黑化血细胞破裂、干枯、形状不规则。同时还可观察到粒血细胞和浆血细胞形成的囊块(图 8b)，结构较致密，菌丝段被包被其中。

被血细胞吞噬或聚集包围的虫菌体，在接种2天后开始突破包围向外生长(图 9a, b)；并随着虫菌体的生长及菌丝体的不断断裂，血腔内菌丝体越来越多，最后血腔内充满菌丝体(图 9c)，导致虫体血液循环不畅，从而因生理饥饿而死亡。

3 结论与讨论

病原真菌侵入昆虫体壁后主要在血腔中繁殖致使虫体僵硬死亡，其成功侵染必须克服寄主血淋巴的免疫防御反应(李季生等，2006；Bradford，1976)。

本研究采用“孢子浴”法对虫体进行接种，比以往多数文献中采用的向虫体注射分生孢子的方法更接近自然界中的实际情况，从而能更真实地反应血细胞对白僵菌的防御能力。

白僵菌能触发家蚕(Bombys mori)(陆龙喜等；2001；时连根等，2001)、棉铃虫(Heliothis zea)幼虫(翟锦彬等，1996)的血细胞防御反应，引起血细胞数目的波动。此外，Mazet等(1994)用感染白僵菌后的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)血清处理其幼虫致使幼虫循环性血细胞数量出现永久性减少。可见，昆虫血细胞对球孢白僵菌有强烈的细胞防御能力，而白僵菌常克服这种防御机制并能继续生长繁殖。

本研究发现桑天牛幼虫的血细胞对侵入体内的白僵菌的菌丝段具有吞噬和囊包作用，这种作用在接种后第2.5天达到高峰，其中主要参与防御反应的粒血细胞和浆血细胞数量急剧上升。然而桑天牛幼虫的血细胞对白僵菌的发展只起暂时的阻碍和抑制作用，难以根本上消除白僵菌菌丝段在血液中大量增殖。由于血细胞在防御反应中大量消耗，其数量随之大幅下降。白僵菌的增殖行为最终导致桑天牛幼虫的死亡。