苹果属(Malus)植物分布在北温带(20°—50°N)，亚洲、欧洲及北美洲均有分布，依起源可分为5大基因中心(李育农，2001), 即东亚基因中心(中国、越南、老挝及日本)、中亚基因分布中心(哈萨克斯坦和吉尔吉斯坦)、西亚基因中心(高加索)、欧洲基因中心(东南欧)及美洲基因中心(北美洲)。

苹果属分类系统繁多，属下组和系的划分复杂, 不同的分类系统苹果属植物种类和数目不一。Rehder(1940)将此属定为25个种，7个近缘种，2个亚种，17个变种，17个杂种和16个类型，隶属于5组6系，5组分别是：真苹果组(Sect. Eumalus)、花楸苹果组(Sect. Sorbomalus)、绿苹果组(Sect. Choromeles)、三裂叶海棠组(Sect. Eriolobus)及多胜海棠组(Sect. Docyniopsis)；Huckins(1972)在其博士论文中将此属定为33个种，在Rehder的分类系统上进行了一些调整，把花楸苹果组下的陇东海棠系(Ser. Kansuenses)与滇池海棠系(Ser. Yunnanese)合并成立了陇东海棠亚组(Subsect. Kansuenses)，移入苹果组中，花楸苹果组只剩佛罗伦萨苹果(Malus florentina)；Ponomarenko(1992)将苹果属分野生种78种，栽培种和杂交种44个，合计122种；Gu等(2003)认为苹果属植物共有55种，其中中国有26种。李育农(2001)则将世界苹果属野生种定为27个种，4个亚种，14个变种，3个变型，属下分为苹果组(Sect. Malus)、山荆子组(Sect. Baccatus)、花楸苹果组、绿苹果组、多胜苹果组(Sect. Docyniopsis)及三裂叶海棠组共6组。美国农业部国家种质资源信息网(http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/splist.pl?7215)公布了苹果属植物136个种、变种及杂交种，包括苹果组、脱萼组(Sect. Gymnomeles)、花楸组、绿苹果组、多胜苹果组及三裂叶海棠组共6组，对于研究属下分类单位的亲缘关系非常便利，所以本文Malus属内分类系统(组、系等)以此为据。

苹果属栽培品种也很多，其中苹果(Malus × domestica)是世界著名的三大果树之一，品种超过7 500个(Ferree et al., 2003)，观赏海棠品种也已达400~600个(Dirr, 1990)。很多苹果属栽培品种的亲本及彼此之间的亲缘关系不详。

苹果属植物的分类主要依据以下性状：果萼是否宿存，叶片是否分裂，叶在芽内的生长状态, 果内有无石细胞等。苹果属植物具多型性特点，单靠形态特征不能说明其种系分类及亲缘关系，只有将传统分类方法和生物化学、分子生物学等相结合，才能建立较科学的分类系统，而任何通过现代科学技术得出的结果均需经典分类学验证。

近30年来分子与生物化学标记已成为研究作物的演化及作物与野生种之间关系的有力工具(Becerra-Velásquez et al., 1994)，RAPD、ISSR等分子标记技术还被广泛地运用到植物分类学上。张敏等(2008)对鸢尾属(Iris)38份野生种进行RAPD分析，经聚类分为6个组，与经典植物分类将鸢尾属划分成6个亚属的结果基本一致。滕元文等(2004)阐述梨属(Pyrus)植物分类的历史时指出：运用分子标记技术研究亚洲原产的梨属植物种及品种，初步明确了东亚原产梨属植物种间、种内的亲缘关系，得出梨属植物应划分为东方梨和西方梨两大类等新结论。

运用分子技术对苹果属分类研究的主要有：Dunemann等(1996)通过RAPD试验认为矮苹果(M. pumila)和森林苹果(M. sylvestris)在栽培苹果的起源中起作用，但并没得出定论；Robinson等(2001)对苹果属29个种及12个苹果品种进行了matK及ITS序列分析, 将苹果属植物分为Sect.Malus(含苹果系、山荆子系和三叶海棠系)、Sect.Sorbomalus(含滇池海棠系和陇东海棠系)和Basaltaxa(含三裂叶海棠组、多胜海棠组、绿苹果组及原属花楸海棠组的佛罗伦萨苹果系)三大类的结果。

AFLP已被广泛地应用到物种遗传变异和系统发生关系的研究中，在种下水平的遗传多样性研究中也发挥重要作用。目前，AFLP技术在园林树种的应用上有火炬松(Pinus taeda)(Remington et al., 1999)、观赏桃树(Prunus persica)(Hu et al., 2005)、杨树(Populus)(李善文等，2007)及玉兰(Magnolia)(贺随超等，2008)等。Liang等(2002)将AFLP技术用于分析苹果属23个野生种及8个变种，得出佛罗伦萨苹果不应列在花楸苹果组，而应属多胜苹果组；稻城海棠(M. daochengensis)、小金海棠(M. xiaojinensis)及马尔康海棠(M. maerkangensis)是变叶海棠(M. toringoidis)变种的结果。用AFLP技术对苹果属植物进行研究的还有Coart等(2003)及其他科学家。

本文用AFLP技术对苹果属72个种、杂交种及品种进行亲缘关系分析，提出了苹果属新的分类观点，阐述部分苹果属栽培品种与原始种的亲缘关系，为有目的地培育苹果属观赏新品种提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 植物材料的采集

72种(23种，4变种，7杂交种，38品种)(表 1)苹果属植物样品，分别采集于位于美国纽约州康奈尔大学的美国农业部植物遗传资源站、位于美国俄亥俄州的斯可里斯树木园以及位于美国俄亥俄州的柯林苗圃。

1.2 DNA的提取

植物材料总DNA的提取是在美国俄亥俄州立大学王国良实验室中进行的。方法据QIAGEN公司DneasyR 96 Plant Kit Handbook及Mixer Mill MM300手册操作。

1.3 AFLP分析

AFLP过程中DNA的酶切与连接、酶切连接物的预扩增和选择性扩增均按美国应用生物公司(Applied Biosystems, P/N 402004, 402005, 4303050)试剂盒(AFLP Plant Mapping Kit)说明书进行。以64对引物预扩增，选出6对扩增产物丰富的引物进行扩增，引物序列分别为AAC-CAT; AAG-CTC; ACA-CAC; ACC-CAA; ACT-CAG; AGG-CTA。PCR反应总体积10 μL，运行退火温度递减程序。扩增产物在ABI 3100测序仪上进行分析，并以GeneScan Rox-500做内标。

1.4 数据分析

用数据采集软件生成样本相应文件，利用GeneMarker(V1.8)软件对以片段大小作为等位基因的指针进行分析(图 1)，不同样本的相同等位基因用二进制表示(Zhou et al., 2003)，1为有，0为缺, 构建0、1矩阵。用NTSYSpc(Ver.2.1)计算软件处理，得到相似系数SC(similarity coefficient)矩阵，并用非加权算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，得出72种苹果属植物样品的AFLP聚类分析图(图 2)。

2 结果与分析 2.1 AFLP的选择性扩增结果

经预备试验，选出6对扩增产物多态性高、清晰且稳定的引物。用这6对引物对72个样品进行AFLP扩增，扩增出1 692条谱带，平均每对引物282条，共有1 547条多态谱带，占总谱带的91.4%(表 2)。

2.2 供试样品的聚类分析

从图 2可看出，72个植物样品之间的相似系数为0.54~0.82。当相似系数为0.60时，样品可划分为4大类：佛罗伦萨苹果单独1种为一类(A)；绿苹果组为第2类(B)；多胜苹果组样品聚为第3类(C)；第4类(D)为花楸组、脱萼组及苹果组的植物。参试样品中苹果品种和观赏海棠品种全聚在原产亚洲的D类。说明亚洲原产的苹果属植物对于苹果品种及观赏海棠品种的发展起重要作用。

B类包含多胜海棠组的台湾林檎及乔劳斯基海棠2个种。

C类则包含北美原产的绿海棠组3个种及2个杂交种，它们是草原海棠、花冠海棠、窄叶海棠、扁果海棠(M. × platycarpa= M. coronaria×M. pumila)及大鲜果(M. × soulardii = M. ioensis × M. pumila)。

D类比较复杂，包含有64种试材，可分为5小组。

D1小组植物隶属脱萼海棠组，包括湖北海棠、垂丝海棠2个种及‘洛基’海棠、‘草莓果冻’海棠2个品种。‘草莓果冻’海棠是湖北海棠的后代(M. huphensis×M. × atrosanguinea)。

D2小组中包含种、杂交种及品种共25个。其中D21中包括花楸组三叶海棠系(Ser. Sieboldianae)共12个样品，有三叶海棠、撒氏海棠2个种及秋果海棠与大果朱密海棠2个杂交种。撒氏海棠最早只在日本园林栽培中存在，没有野生自然分布，'提娜'海棠是其杂交后代选出的品种，它们与原产中国东部、朝鲜及日本的三叶海棠关系密切；AFLP的聚类结果与它们实际的亲缘关系非常吻合。秋果海棠(M. prunifolia × M. toringo，M. toringo是三叶海棠M. sieboldii的异名)的亲本之一为三叶海棠，而大果朱密海棠也是三叶海棠的后代(M. baccata var. mandshurica × M. sieboldii)。在D21中与三叶海棠有关的品种还有：‘白天使’海棠、‘斯教授’海棠(M. baccata var. mandshurica×M. sieboldii)，亲本不详的观赏海棠品种‘哨兵’、‘灰姑娘’、‘密果垂枝’及‘印第安魔力’聚在此组，由此推测它们与三叶海棠系的植物关系密切，为将来找到它们的亲本及新建育种组合应有帮助。D2组中其他植物包含苹果组在自然界没有分布的多花海棠，以及与之关系密切的阿诺德海棠(M. floribunda×M. baccata)、‘红玉’海棠(M. floribunda×M. prunifolia)和从多花海棠中选出的品种‘贝夫利’海棠；‘卡拉维’海棠的亲本之一是原产我国东部的楸子；‘金峰’海棠(M. baccata var. mandshurica × M. sieboldii)是三叶海棠的后代；亲本不详的观赏海棠品种‘饴糖’、‘唐纳得’、‘雪球’均聚于此组；此组中的深红海棠是垂丝海棠与三叶海棠的天然杂交(M. halliana × M.sieboldii)，其后代‘紫王子’海棠(M. pumila ‘Niedxwetzkyana'×M. × atrosanguinea)也聚在此组；‘红天鹅’与‘白保波’亲本不详。但AFLP分析可证明它们与多花海棠及三叶海棠关系较近。

D3类包括脱萼组与苹果组植物6个种、变种及杂交种与7个品种，其中苹果组植物只有海棠花, 该种是起源地不明，很可能是天然杂交种。原始种及变种有毛山荆子、毛山定子及朝鲜山荆子，哈威氏海棠是山荆子与垂丝海棠的杂交种(M. baccata × M. halliana)，而麦格迪海棠是海棠花的后代(M. pumila × M. spectabilis)。‘春雪’海棠在相似系数0.694的地方与其亲本‘道格’海棠聚为一类，山荆子是‘道格’海棠的亲本；‘皇杖’海棠及‘爱迪鲁’海棠是从垂丝海棠品种(M. halliana ‘Koehne')开放式授粉实生苗中选出的品种；‘爱尔美’海棠与‘红丽’海棠则均是山荆子与矮苹果的杂交品种；‘杜邦’海棠是阿诺德海棠与紫叶海棠的品种(M. × purpurea ‘Eleyi')杂交而得；‘戴卫’海棠的亲本之一是垂丝海棠。‘世纪’海棠是山荆子和楸子的后代。

D4类包含苹果组的13个试材，其中有5个种与变种：楸子、塞威氏苹果、土库曼海棠、吉尔吉斯海棠及矮苹果等，它们多与现代苹果品种的起源有密切关系(Jules, 2003)；2个杂交种也聚在此类，它们是扁棱海棠(M. baccata × M. prunifolia)及道生里安娜海棠(M. × dawsoniana= M. fusca× M. pumila)；另外D4中还有3个苹果品种及2个观赏海棠品种：‘红元帅’苹果与‘富士’苹果，前者为后者的父本，它们在相似系数为0.82时聚在一起，是所有样品中关系最近的, 同时‘自由’苹果也聚在此组；‘玫红杂种海棠’(Rosybloom Hybrids)是以红肉苹果(M. pumila ‘Niedzwetzkyana')为亲本的一组开深红色花的早期现代海棠品种，其中‘爱密斯科'海棠(M. atrosanguinea × M. pumila ‘Niedzwetzkyana')、‘马卡米'海棠(红肉苹果的实生苗)及‘箭’海棠(也是红肉苹果的实生苗)聚在此组。

亲本不详的‘慢果’海棠游离于花楸组与其他组之间，亲缘关系有待进一步研究。

D5为花楸组的6个原始种，分别为滇池海棠、西蜀海棠、河南海棠、花叶海棠、褐海棠及甘肃海棠。分布于北美洲西部的褐海棠在形态上与分布在中国西部及西南的花楸组滇池海棠系的植物很相似，所以在传统分类中将其划分到花楸组。AFLP聚类图验证了这一结果。当相似系数为0.68时，云南海棠系的滇池海棠、西蜀海棠及河南海棠与甘肃海棠系的花叶海棠、褐海棠及甘肃海棠分为2组。

3 讨论 3.1 根据AFLP的分析结果对苹果组的重新界定

本文AFLP试验得出的聚类分析图与传统形态分类的主要差异之一为佛罗伦萨苹果分类位置的处理。佛罗伦萨苹果分布于西亚(土耳其)及欧洲(阿尔巴尼亚、希腊、意大利、南斯拉夫), 1906年被更定、描述及发表(Schneider, 1906)，学名为Malus florentina (Zuccagni) C. K. Schneid.。由于叶片像山楂属(Crataegus)植物，早期分类学家认识不足，把它放在山楂属，定名为Crataegus florentina Zuccagni (Roemer et al., 1809)，Koehne(1890)将其划分到苹果属，定名为Malus crataegifolia (Savi) Koehne。期间Savi(1811)将其放入梨属，学名为Pyrus crataegifolia Savi。Rehder(1940)将其纳入花楸组单一系(Ser.Florentinae)；Huckins(1972)将其作为花楸苹果组下唯一的1个种，把其他的种都纳入陇东海棠亚组(Subsect.Kansuenses)；Williams (1982)通过类黄酮物质的检测将其纳入多胜海棠组。也有人认为它是花楸属与苹果属的属间杂交种(Browicz，1970；Stace，1975)。成明昊等(2001)认为“在苹果属植物的分类系统中，弗洛伦萨海棠未显示出种类间的演化关系；地理分布是隔离的，未显示出种类间分布的规律性；并具有独特的形态特征。因此弗洛伦萨海棠应当作为1个单种组，其种的名称也可以作为组的名称，可命名为弗洛伦萨海棠组(Sect.Florentinae Cheng M.H.)”。本文AFLP试验聚类分析结果支持其结论。

在本文聚类结果中，花楸组、脱萼组及苹果组的种之间互有交叉。苹果属植物具多形性特点，仅凭形态特征不能说明该属种类之间的亲缘关系。根据本文试验结果，建议将原花楸组除佛罗伦萨苹果外全部并入苹果组，将脱萼组中植物亦并入苹果组，撤销脱萼组。建议成立一单种组——佛罗伦萨苹果组。

由于试材中没有三叶海棠(M. trilobata)，使本试验少了1个可以对照的组。

3.2 已知与未知亲本的苹果属品种的初步识别

观赏海棠品种在近200年于西方发展很快，有些品种的育种过程有记载(Jefferson, 1970；Fiala，1994)。1920年Niels Hansen用原产中亚、在我国新疆有分布的红肉苹果与山荆子杂交，得到深红色花的品种——‘霍巴’海棠(Malus 'Hopa')，从此有红肉苹果血统的，花色红、深红，甚至紫红的“玫红杂种海棠”品种不断被培育出来，多数开深红色花的现代观赏苹果品种都是由此发展而来的。本试验中的3个玫红杂种海棠‘爱密斯科'海棠、'马卡米'海棠与‘箭’海棠全都聚在了与红肉苹果关系最近的矮苹果周围，验证了这些观赏海棠品种与其亲本的关系。同样本试验也验证了‘红元帅’、‘富士’及‘自由’等苹果品种的亲缘关系。‘春雪’海棠与其亲本‘道格’海棠也聚在一起。

1991年由美国俄亥俄州Lake County Nursery培育的品种‘灰姑娘’亲本不详，株型甚矮(1.8 m)且紧密，花苞红色，开后花白色，在形态上与撒氏海棠很像，而在本试验中确实显示此品种与撒氏海棠亲缘关系很近(相似系数0.74)，初步推测撒氏海棠是其亲本之一。如要培育小型观赏海棠品种，撒氏海棠不失为首选育种材料。

亲本不详的观赏海棠品种‘哨兵’、‘密果垂枝’及‘印第安魔力’聚在三叶海棠系组中，初步推断它们与三叶海棠系的植物关系密切。

3.3 建议

本试验说明AFLP技术对于更好地揭示苹果属植物种、变种、杂交种及品种之间的亲缘关系，并诠释及补充传统分类学所不足，有一定的参考价值。从本文结果来看，亚洲原产的苹果属植物对于苹果品种及观赏海棠品种的发展起重要作用。

苹果属植物在中国栽培历史悠久，育种资源极为丰富，但名称混杂，谱系不清，许多品种的学名不符合《国际植物命名法规》(Greuter et al., 1999)及《国际栽培植物命名法规》(Trehane et al., 1995)，如：槟子(M. domestica subsp. chinensis var. binzi Li Y.N.)、林檎(M. domestica subsp. chinensis var. rinki(Koidz.)Li Y.N.)、香果(M. domestica subsp. chinensis var. xianggoe)、垚婆(M. domestica subsp. chinensis var. pingpo)等；另外同名异物、同物异名及没有学名的品种也很多，如：八楞子、冷海棠、暖海棠、白果、白彩萍、红彩萍等。建议建立国家观赏海棠资源圃，收集整理国内苹果属资源，应用先进的分子技术，弄清谱系，为培育具中国自主知识产权的新品种打好基础。