高温已成为影响植物正常生长的主要因素之一，尤其是我国南方的夏季高温已经成为制约许多植物生长和发育的主要环境因子，也给林草生态安全和植被景观带来极大隐患。高羊茅(Festuca arundinacea)，是常见的冷季型草坪草中绿期最长、应用最广的草种之一(周嘉友等，1998；韩春梅等，2006)，在气候冷凉地区能周年常绿，在长江中下游气候过渡区绿期也相对较长，但在高温季节常出现大面积枯黄现象。在长江以南地区，因长期处于夏季高温的影响，普遍存在难以越夏的问题。因此高温胁迫成为高羊茅在我国南方草坪发展的主要限制因子。目前, 国内外已有许多关于高羊茅耐热性方面的研究(何亚丽等, 2002；徐胜等，2008；Cui et al., 2006；Jiang et al., 2001；Zhao et al., 2008)。高温胁迫能明显降低高羊茅的光合速率和PSII活性(Cui et al., 2006)，而通过叶面喷施N肥可以明显减缓高温下高羊茅叶片净光合速率、气孔导度、水分利用效率和PSII最大光化学效率的下降(Zhao et al., 2008)。通过热锻炼能提高高羊茅在忍受高温过程中的耐热性(徐胜等，2008)，对高羊茅叶片喷施水杨酸或Ca²⁺能够提高叶片超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性从而提高耐热性(何亚丽等, 2002；Jiang et al., 2001)。前人对高羊茅等草坪草耐热性的研究大多集中在短期高温对叶片光合速率、抗氧化酶活性、膜脂过氧化等方面，对于长期处在高温环境过程中草坪草的光合作用、叶绿素荧光特性和光能分配等研究未见报道。本试验根据南方夏季高温对草坪草的实际情况，研究长期高温胁迫对高羊茅气体交换参数、叶绿素荧光参数、能量分配、叶绿素含量和抗氧化酶等的影响。以期了解长期高温对高羊茅的作用机制。

1 材料与方法 1.1 供试材料与培养

高羊茅品种为猎狗5号(Festuca arundinacea cv. ‘Houndog 5’)。种在不同的花盆中，置光照培养箱内培养。光强为600 μmol·m^-2 s^-1, 温度为20 ℃/18 ℃(昼/夜)，光周期为12 h，相对湿度为70%~75%。待植株长到5叶1心时，将其中一半高羊茅转移至另一光照培养箱进行高温处理，处理的最终温度为35 ℃/26 ℃(昼/夜)，处理时昼温度从20 ℃开始每小时温度升高2 ℃，夜温由培养箱自行调节，其余条件不变，原培养箱的一半作为对照。处理第30天测定叶片气体交换参数和叶绿素荧光参数，每次均测定第2完全展开叶片(自上而下)，测定后取相同的叶片用于测定叶绿素含量和抗氧化酶类等指标。

1.2 气体交换和叶绿素荧光参数测定

用便携式光合测定系统(LiCor-6400，USA)和荧光叶室(6400-09)同时测定气体交换和叶绿素荧光参数，每次测定至少重复4次以上；所有测定时的气体流量均为500 μmol·s^-1；测定条件为CO₂浓度为(385±5) μmol·mol^-1；F_o和F_m的是在叶片暗适应15 min后进行，用测量光先测定F_o，再用饱和的红蓝光照射，获取最大荧光(F_m)，F_v/F_m＝(F_m-F_o)/F_m；光响应曲线测定时光强设置为2 000，1 600，1 200，1 000，800，500，200，100，50，20，0 μmol·m^-2s^-1。其他的叶绿素荧光参数计算公式按Genty等(1989)的公式计算：PSⅡ的实际量子产额(Φ_PSⅡ)＝(F′_m-F_s)/F′_m，开放PSII反应中心激发能捕获效率F′_v/F′_m= (F′_m-F′_o)/F′_m；光化学猝灭系数q_P= (F′_m-F_s)/(F′_m-F′_o)；非光化学猝灭NPQ = F_m/F′_m-1；电子传递速率(ETR)按Bilger和Bjôrkman的方法测定(1990)。PSⅡ吸收的光能分成3部分，在光强为800 μmol·m^-2s^-1时，用于PSII光化学反应(P)、天线耗散(D)和过剩光能(E_x)分别所占的比率根据Demmig-Adams等(1996)的公式计算。

1.3 CO₂响应曲线测定

利用CO₂钢瓶完成，测定时的气体流量均为500 μmol·s^-1，光照强度为1 200 μmol·m^-2s^-1。参比室CO₂浓度设置按400，300，200，100，50，400，400，600，800，1 000，1 200，1 600 μmol·mol^-1，每浓度适应4~6 min。测定由LI-6400内置程序自动完成。Rubisco最大羧化效率(V_{c, max})和RuBP最大再生速率(J_max)用Photosyn Asisstant软件计算。

1.4 NPQ的诱导和恢复动力学测定

按照Quick等(1989)的方法进行。每分钟读取1个数值，由仪器自动完成。待仪器读取第15个值时关闭作用光。高能态猝灭(q_E)和光抑制猝灭(q_I)按照Thiele等(1997)的方法计算。

1.5 叶绿素和可溶性蛋白含量的测定

参照Huang的方法(2004)。可溶性蛋白质的含量按考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白作标准曲线，计算可溶性蛋白含量。

1.6 抗氧化酶类活性的测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性根据Giannopolitis等(1977)的方法以抑制NBT光化学还原的能力来测定。过氧化物酶(POD)活性测定采用Braber(1980)的方法，根据470 nm波长下吸光度的增加来计算。过氧化氢酶(CAT)的活性根据Jiang等(2001)的方法，通过测定H₂O₂在240 nm下的降解速度来计算。抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性根据Nakano等(1981)的方法测定。谷胱甘肽还原酶(GR)活性采用Foyer等(1976)的方法测定。

1.7 丙二醛(MDA)含量的测定

含量测定参照Huang等(2004)的方法，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定MDA的形成。

2 结果与分析 2.1 长期高温对高羊茅气体交换参数的影响

在各个光强和CO₂浓度下，高温胁迫均使高羊茅的光合速率下降，在高光强和高CO₂浓度下显著(图 1)。利用Photosyn Asisstant软件对P_n-PFD和P_n-C_i响应曲线分析表明，长期高温处理使高羊茅表观量子效率AQY，Rubisco最大羧化效率V_{c, max}、RuBP最大再生速率J_max、羧化效率CE和光饱和点分别下降29.9%，37.4%，41.2%，36.2%和38.9%。而光补偿点和CO₂补偿点则分别上升6.9%和9.5%.

2.2 长期高温对高羊茅F_v/F_m，F_v′/F_m′，Ф_PSⅡ，q_P和ETR的影响

在长期高温胁迫下，高羊茅的最大光化学效率F_v/F_m明显降低(表 1)。在任何光强下受高温胁迫的高羊茅的PSII反应中心激发能捕获效率(F′_v/F′_m)都更低(图 2A)。光化学淬灭(q_P)随着光强呈直线下降(图 2B)。高温胁迫下，q_P的下降幅度比对照的更大。q_P值的大小反映的是原初电子受体Q_A的氧化还原状态和PSⅡ开放中心的数目(Maxwell et al., 2000)，高温胁迫下q_P值越低表明说明质体醌(PQ)还原程度随高温胁迫而增加。PSII实际量子效率Ф_PSⅡ反映PSⅡ反应中心在环境胁迫中有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率, 也是实际的PSⅡ反应中心进行光化学反应的效率，其值越小, 说明电子传递活性越小(Maxwell et al., 2000)。在每个光强下，高温胁迫下的Φ_PSⅡ都比对照低得多(图 2C)。根据Φ_PSⅡ计算线性电子传递速率(ETR)可知：高温胁迫下的ETR比对照的小得多，饱和ETR值大约只有对照的55%左右。而且高温处理下，高羊茅的ETR饱和光强只有500 μmol·m^-2s^-1左右，而对照则为1 000 μmol·m^-2s^-1左右(图 2D)。

2.3 长期高温对高羊茅NPQ及其组分的影响

NPQ的光强响应曲线，结果如图 3A所示。在低光强下，高温处理后高羊茅的NPQ和对照的无明显差异，但光强超过500 μmol·m^-2s^-1 时，高温处理下高羊茅的NPQ随光强上升缓慢，而对照则仍然迅速上升，饱和NPQ值显著高于高温处理的高羊茅。根据荧光暗恢复动力学并分别计算出NPQ的组分高能态猝灭(q_E)和光抑制猝灭(q_I)。q_E是NPQ的主要组分，正常条件下占80%以上。q_E的随光强变化的趋势基本和NPQ一致(图 3B)，说明高温处理下NPQ的下降主要是由于q_E的下降引起的。在光强高于200 μmol·m^-2s^-1时，高温处理的高羊茅的q_I比对照高得多(图 3C)。q_I的升高表明高温处理增加高羊茅对高光强的敏感性。

2.4 长期高温对高羊茅吸收光能分配的影响

将叶片吸收的光能分为3部分(Demmig-Adams et al., 1996)：一是用于PSⅡ光化学反应的部分P, 二是通过天线热耗散的部分D，三是PSⅡ反应中心的过剩激发能E_x。在正常温度下，高羊茅吸收光能中的46.6%用于光化学反应，36.8%用于天线耗散，16.6%为PSII反应中心的过剩光能(表 3)。尽管高温处理使NPQ明显下降，但高温处理使天线耗散的能量的比例却略有上升，从对照的36.8%增加到39.3%；另外高温下PSII过剩光能的比例也显著上升，处理30 d后起增加到31.4%；用于光化学反应的部分则大量下降，说明高温处理降低光合作用CO₂同化的电子需求。

2.5 长期高温对高羊茅叶绿素、抗氧化酶类和脂质过氧化的影响

高温处理后，总Chl比对照降低29.3%，而Chla/b比对照上升35.7%。这说明Chlb比Chla下降得更快，而Chlb主要存在于2个光系统的天线色素中，这说明高温处理后叶片吸收和传递到PSⅡ反应中心的光能降低，这与前面提到的F′_v/F′_m等变化一致。另外，高温处理明显降低SOD，POD，CAT，APX和GR的活力，高温30 d后，SOD，POD，CAT，APX和GR活力分别比对照降低49.9%，47.7%，24.2%，41.9%和56.0%。但MDA含量却上升了52.4%。

3 讨论

高温处理导致P_n的明显下降和光补偿点、CO₂补偿点的上升, 这说明高温处理降低了高羊茅对光强和CO₂的利用效率。根据Farquhar等(1980)提出的光合作用模型，高温处理30 d后，CE, V_{c, max}及J_max都显著降低，而前二者直接取决于Rubisco羧化酶的活性变化, J_max则取决于电子传递过程中同化力和RuBP再生系统中酶活性的高低(Long et al., 2003)，因此高温胁迫明显降低Rubsico羧化酶的活性和RuBP再生速率，表现为CO₂补偿点的上升。

高温胁迫30 d后，F′_v/F′_m, q_P，Ф_PSⅡ和ETR等参数明显下降，说明长期高温使天线色素光能转换效率和PSⅡ反应中心开放部分的比例明显下降，用于CO₂同化的光能减少，使过量的激发能在PSII反应中心的积累，从而降低光合电子传递能力，限制的RuBP再生能力。高温处理使叶绿素含量大量下降，Chla/b上升，说明Chlb的降解速度较快，从而使捕获和传递给PSII反应中心的光能减少。但高温处理明显使F_v/F_m减小，尽管传递给PSII的光能减少，但长期高温仍然使高羊茅遭受严重的光抑制，表现为光饱和点的明显下降。

植物在吸收的光能超过所利用的能量时，会启动非辐射能量的耗散途径来耗散过剩的激发能以保护光合机构免受伤害(Demmig-Adams et al., 1996)。本试验结果表明:长期高温处理后NPQ明显降低，长期高温胁迫下，高羊茅的能量耗散机制可能遭到伤害。q_E是NPQ的主要部分，它依赖于跨类囊体膜的pH梯度(ΔpH)，并受叶黄素循环等许多因素调控(Müller et al., 2001)。本研究中q_E在长期高温下变化趋势与NPQ基本相同，表明NPQ的下降主要是由于q_E的下降引起的。由于长期高温胁迫使电子传递降低，从而ΔpH不同有效的形成，使得能量耗散机制遭到伤害。q_I也是NPQ的重要组成部分，主要光抑制程度相关，Rubisco活化酶的失活、D1蛋白的降解和PSII反应中心的失活可能在这种机制中起作用(Müller et al., 2001)。本研究结果表明高温胁迫使q_I明显上升，说明长期高温使高羊茅受到明显的光抑制，这一结果与F_v/F_m的变化相吻合。

为了解高羊茅在长期高温胁迫下的光能利用情况，我们将植物吸收的光能分为3部分。结果表明：长期高温胁迫下PSII过剩光能E_x显著上升，用于光化学反应的能量则大量下降。E_x的增加导致光合电子传递到O₂的相对比例增加，可形成更多的氧自由基、过氧化氢、羟基自由基等活性氧物质(徐红霞等，2005)。本研究中SOD，POD，CAT，APX和GR等抗氧化酶活力均大量下降，说明在长期的高温胁迫下，活性氧物质不能被抗氧化酶有效的清除掉。而MDA含量的大量上升说明活性氧已经积累到一定程度并诱发膜脂过氧化(Liu et al., 2000)，这可能也是ΔpH不能有效形成的重要原因之一。