朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种世界范围的重要经济害虫，危害100多种大田及温室的农作物和果树(Hazan et al., 1974；Ho et al., 1997)，严重影响其产量和品质。它具有体积小、繁殖快、适应性强及易产生抗药性等特点，是公认的最难防治的有害生物类群(何林等，2004)。长期以来，对螨类的控制主要依赖化学农药，但过度频繁的使用化学农药无可避免地加剧了螨类抗药性的产生，同时也杀伤了大量天敌昆虫，破坏了生态平衡，从而导致了抗性(resistance)、再增猖獗(resurgence)和残留(residue)等“3R"问题的产生。因此，综合治理螨类的关键是选用对环境友好的、能自然降解的选择性杀螨剂(Mansour et al., 2004)。

牵牛子(semen pharbitidis)系旋花科植物圆叶牵牛(Pharbitis purpurea)或裂叶牵牛(Pharbitis nil)的干燥成熟种子，始载于公元五世纪陶宏景编著的《名医别录》中，全国各地均有野生或种植，其味苦、性寒、有毒(陈立娜等，2004)。牵牛子主要含有牵牛子苷、糖类物质和多种生物碱等。敖冬梅等(2003a)在利用钙调神经磷酸酶(calcineurin)的分子模型广泛筛选能改善老年痴呆症的天然药物的过程中发现，牵牛子粗提物具有明显激活钙调神经磷酸酶的作用。另外，牵牛子也是一种极具开发潜力的杀虫植物材料，已报道其对小菜蛾等有很高的杀虫活性(徐向荣等，2006)，但对朱砂叶螨的活性研究还未见报道。本文以朱砂叶螨为研究对象，对牵牛子的杀螨活性成分的提取和分离等一系列方面进行了研究，目的在于为开发出一种经济、安全、有效的新型杀螨剂提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

牵牛子购自北京市同仁堂大药房。将干燥的牵牛子用高速粉碎机(型号：6202，北京环亚天元机械技术有限公司制造)粉碎后过40目筛，放入冰箱(型号：BCD-278WNN，青岛海尔股份有限公司生产)中贮藏备用；朱砂叶螨源于室内饲养的敏感品系，温度(25±1)℃，相对湿度为(50±10)%，光照L:D=18 h:6 h。

1.2 提取方法

将粉碎好的牵牛子分别选用3种极性不同的石油醚、氯仿、甲醇有机溶剂(分析纯，来自北京化工厂)浸泡。将一定量的牵牛子干粉装入广口瓶中，加入干粉5倍量的溶剂，浸提3~5 d，减压浓缩，以此方式反复3次，合并提取物。

1.3 杀螨活性成分的初步追踪分离 1.3.1 采用液-液分配法

室内生物活性测定结果表明石油醚提取物生物活性最高，因此，选择石油醚提取物进行下一步分离纯化。用10倍量的石油醚溶解石油醚提取物，装入分液漏斗中，采用液-液分配法用甲醇萃取3次，合并萃取液，减压浓缩。

1.3.2 柱层析分离法

采用中压层析(BUCH Switzerland)进行柱层析分离。层析用硅胶(200~300目)(青岛海洋化工)，干法装柱，准确称取石油醚萃取物10 g，加一定量硅胶拌匀，装入上样柱中，用氮气吹实；层析硅胶柱用氮气吹实，石油醚润洗，之后依次用纯石油醚、石油醚:氯仿(9:1，8:2，7.5:2.5，6:4，5:5，3:7)、纯氯仿洗脱，控制洗脱剂流速在10 mL·min^-1，每10 min收集1份，共分离得616份物质。然后用薄层层析以纯石油醚、石油醚:氯仿(9:1，7:3，5:5)、纯氯仿为展开剂检查，根据Rf值的大小合并相同部分，共得到12份不同的组分。

1.4 生物活性测定的方法 1.4.1 成螨触杀作用

参照Busvine(1980)推荐的玻片浸渍法并稍作改进，将双面胶带粘贴于玻片一端，揭去上面的纸片，用零号毛笔挑取大小一致、颜色鲜艳的活泼雌成螨，将其背部粘在双面胶带上，不可粘住螨足、口器及须肢，保证螨足自由活动，每片粘约30头，粘好的玻片在双目解剖镜(型号：SZW-45B3，浙江舜宇光电有限公司)下检查，剔除不活动、受伤和粘的不合格的螨，将供试螨浸入待测药液中轻轻摇动约5 s钟后取出，用吸水纸条小心吸去螨体周围的多余药液。每处理设3个重复，以蒸馏水加1%体积的吐温-80为空白对照，放在同等饲养条件下培养。24 h后在双目解剖镜下检查结果，用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。

1.4.2 杀卵作用

参考Busvine(1980)推荐的叶片残毒法并加以改进，采集新鲜的豇豆(Vigna seaquipedalis)叶片，叶柄截去0.5 cm，并在叶柄上包上湿棉球，放在垫有一层湿棉花的培养皿中，每片叶片接雌成螨20头，置于(25±1)℃下任其产卵24 h，去除雌成螨，检查记录卵粒数后，置于25 ℃恒温培养箱中，当卵龄达到36~48 h时进行测定，将带卵的叶片浸入各处理药液5 s，然后放在吸水纸上阴干，放回垫有一层湿棉花的培养皿中，待对照组卵孵化并发育至若螨阶段(约5 d)，处理卵还没有孵化视为判断死亡的标准，检查统计各处理死亡率。每处理设3个重复，以蒸馏水加1%体积的吐温-80为空白对照。

1.4.3 产卵抑制作用

参照张永强(2005)的方法并加以改进，采集新鲜的豇豆叶片，叶柄截去0.5 cm，并在叶柄上包上湿棉球，放在垫有一层湿棉花的培养皿中(叶片背面向上)，在叶背画出一个约3 cm²区域，区域周围用湿润的细棉条围住，区域中叶片涂布药液后晾干，接入雌成螨20头，统计24，48，72 h的产卵量。每处理设3个重复，以蒸馏水加1%体积的吐温-80为对照。计算产卵抑制指数和产卵抑制率。产卵抑制指数=(对照产卵数－处理产卵数)/(对照产卵数+处理产卵数)；产卵抑制率(%)=(对照产卵数－处理产卵数)/对照产卵数×100%。

1.4.4 驱避活性测定

参照周琼等(2002)的方法，在垫有一层湿棉花的培养皿中放一片新鲜豇豆叶片(叶片背面向上)，叶片边缘用湿润的细棉条围住，防止害螨逃逸。将杀螨活性物质配成2 mg·mL^-1的药液，用蒸馏水加1%体积的吐温-80作为对照。用毛笔分别蘸取配好的处理液和对照液，均匀地涂在豇豆叶片主脉两侧(包括边缘棉条)，晾干后形成药膜，做好标记。用零号毛笔将40头害螨移入叶片中脉上，在解剖镜下检查，保证移入的都是健康雌成螨。每处理3个重复，分别于12，24，48和72 h观察叶片两侧害螨驻留情况(中脉上不算)，记载叶片上螨数，算出驱避率。驱避率(%)=[(C-T)/C]×100%，C为对照叶片的螨数，T为处理叶片的螨数。

1.5 数据处理方法

所得数据用Finney机率分析法求出毒力回归式，并对该方程式进行卡方适合性检验。当回归式符合实际情况后，求出致死中浓度(LC₅₀)和LC₅₀值的95%置信限。方差分析和校正死亡率的计算方法分别依据Duncan's法和Abbott(1925)公式。所有处理均用EXCEL进行。

2 结果与分析 2.1 牵牛子提取物对朱砂叶螨生物活性的测定 2.1.1 牵牛子提取物对朱砂叶螨的触杀作用

由表 1可以看出：3种溶剂对牵牛子进行提取，甲醇的提取率最高，氯仿次之，石油醚最低，且各溶剂之间的提取率存在显著的差异(P＜0.05)。将3种提取物配制成质量浓度为2 mg·mL^-1的溶液进行生物活性测定，对照为1%吐温-80溶液，结果见表 2。石油醚提取物对朱砂叶螨的雌成螨和卵的生物活性显著(P＜0.05)高于甲醇提取物和氯仿提取物，其24 h后的校正死亡率分别达到93.7%和77.3%。

将石油醚提取物稀释成5个不同梯度质量浓度对朱砂叶螨进行生物活性测定，求出毒力回归方程及致死中量(LC₅₀)，结果见表 3。石油醚提取物对雌成螨和卵的LC₅₀分别是0.697 9和1.303 7 mg·mL^-1，具有很好的生物活性。由此可见，牵牛子石油醚提取物中含有对朱砂叶螨的雌成螨和卵的活性成分。

2.1.2 牵牛子提取物对朱砂叶螨的产卵抑制作用

从表 4可以看出，无论从产卵抑制指数还是产卵抑制率来看，石油醚提取物的活性都高于甲醇和氯仿提取物。且在24，48，72 h后石油醚提取物的产卵抑制率与其他提取物之间均存在显著差异(P＜0.05)，其产卵抑制率依次为82.51%，75.01%，71.43%。随着时间的延长可以看出3种提取物的产卵抑制率都呈下降趋势，尤其是48 h后甲醇和氯仿提取物效果急剧下降，抑制率低于60%，但石油醚提取物下降趋势平缓，72 h后仍高于70%。

2.1.3 牵牛子提取物对朱砂叶螨的驱避作用

由图 1可以看出石油醚提取物对朱砂叶螨具有很好的驱避作用，处理后12，24，48，72 h的驱避率依次为100%，94.54%，84.86%，71.37%。经显著性分析，12，24，48，72 h后石油醚提取物的驱避率与其他提取物之间均存在显著差异(P＜0.05)。甲醇和氯仿提取物12 h后对朱砂叶螨的驱避率分别为82.29%和89.6%，但72 h后驱避率均低于60%，说明这2种提取物只具有速效性，持效期较短。而石油醚提取物对朱砂叶螨的速效性强且持效期较长。

2.2 牵牛子萃取物对朱砂叶螨生物活性的测定

采用液-液分配法对牵牛子石油醚提取物进一步萃取。由表 5可以看出：2种不同溶剂之间萃取率存在显著差异(P＜0.05)，即石油醚相大于甲醇相。将2种萃取物配制成质量浓度为2 mg·mL^-1的溶液进行生物活性测定，对照为1%吐温-80溶液，结果见表 6。石油醚萃取物对朱砂叶螨的雌成螨和卵的生物活性显著(P＜0.05)高于甲醇萃取物，其24 h后的校正死亡率分别达到96.2%和82.1%。因此，石油醚是提取和萃取牵牛子中对朱砂叶螨的雌成螨和卵有效活性成分的最佳溶剂。

将石油醚萃取物稀释成5个不同梯度浓度质量进行生物活性测定，分别求出毒力回归方程及致死中量(LC₅₀)，结果见表 3。石油醚萃取物对成螨有较高活性，其LC₅₀为0.504 2 mg·mL^-1，也有较好的杀卵效果，LC₅₀为1.101 6 mg·mL^-1。牵牛子石油醚萃取物具有很好的杀螨活性。

2.3 牵牛子石油醚萃取物柱层析所得不同流分杀螨活性的测定

为进一步了解牵牛子中的活性成分，采用中压柱层析对其石油醚萃取物进一步分离，共得到流分616个，经TLC检测后，相同成分合并得到12个流分。将这12个流分分别配成质量浓度为2 mg·mL^-1的溶液，进行生物活性测定，结果见表 8。雌成螨校正死亡率达到60%以上的有流分2，6，7，8，9，分别为60.7%，68.7%，83.8%，96.3%，80.9%，其中以流分8的效果最好；流分9的提取率最高。流分8对雌成螨的触杀效果与其他流分之间存在显著差异(P＜0.05)。

将流分7，8，9稀释成5个不同梯度质量浓度进行生物活性测定，分别求出毒力回归方程及致死中量(LC₅₀)，结果见表 9。流分8对成螨触杀活性最高，其LC₅₀为0.447 7 mg·mL^-1。

3 结论与讨论

通过生物活性测定得出石油醚是提取和萃取牵牛子中对朱砂叶螨的雌成螨和卵有效活性成分的最佳溶剂。石油醚提取物对朱砂叶螨的雌成螨和卵的校正死亡率分别达到93.7%和77.3%，LC₅₀分别是0.697 9和1.303 7 mg·mL^-1；24，48，72 h后对朱砂叶螨的产卵抑制率依次为82.51%，75.01%，71.43%；处理后12，24，48，72 h对朱砂叶螨的驱避率依次为100%，94.54%，84.86%，71.37%。石油醚萃取物对雌成螨和卵校正死亡率分别达到96.2%和82.1%，LC₅₀分别是0.504 2和1.101 6 mg·mL^-1。进一步柱层析分离，得到的12个流分中流分8的活性最高，对雌成螨的校正死亡率达到96.3%，LC₅₀是0.447 7 mg·mL^-1。由此可见，牵牛子中含有对朱砂叶螨的有效活性成分，是一种极具开发的植物源杀螨剂。

目前，牵牛子的化学成分研究较多。牵牛子含牵牛子苷约2%，是主要的活性及有毒成分，在肠内遇胆汁及肠液分解出牵牛子素，刺激肠道，增进肠蠕动，导致泻下；牵牛子中还含有多种生物碱，其中麦角碱和异麦角碱具有中枢效应，尤以精神症状为突出，该类成分具有与强致幻剂麦角酸二乙酰胺相似的结构和作用(敖冬梅等，2003b)；此外还含有蒽醌和酚酸等有效成分。陈立娜等(2004)对牵牛子有效成分的分离首次获得了大黄素甲醚、大黄素、大黄酚、咖啡酸乙酯、咖啡酸等。牵牛子含脂肪油约11%，陈立娜等(2003)采用GC-MS联用技术对牵牛子石油醚浸提得到的脂肪油类成分进行了系统的研究。李澎灏等(2003)确定了牵牛子中含有大量的脂肪酸。

徐向荣(2005)对圆叶牵牛的各部位(种子、花萼、藤)用6种不同极性溶剂进行了提取，通过生物活性测定，表明种子甲醇提取物对小菜蛾活性最强，触杀试验表明石油醚提取物活性仅次于甲醇提取物。本试验也说明牵牛种子中含有杀螨活性物质，主要存在于石油醚提取物中。从中可以推测牵牛子石油醚提取物中可能含有对多种农业害虫有效的活性物质，具有很大的开发潜力。曹挥等(2007)对地肤(Kochia scoparia)的各部位(根、茎、叶、种子)氯仿提取物进行了生物活性测定，结果表明地肤种子中含有对山楂叶螨的活性物质。有研究报道苍耳子(Fructus xanthii)中含有对小菜蛾的活性物质(周琼等，2006)，蛇床子素已被登记和推广使用。因此，可以推测植物的种子中可能含有较多对农业害虫有效的活性物质，为植物源农药的开发提供更丰富、更有价值的资源。

本文报道了牵牛子的杀螨活性，通过症状观察发现，用流分8处理成螨后，螨先是静止不动，接着进入兴奋期、麻痹期和死亡期，产卵量急剧下降，并有体表皱缩现象。由于活性成分是从石油醚中提取和萃取的，流分8很有可能是酯类物质，但对该物质的结构鉴定、作用方式、生化机理和田间试验等有待于进一步研究。