苹果褐斑病(Marssonina coronaria)是引起我国苹果(Malus)树早期落叶的主要病害，在各苹果产区均有分布，早期大量落叶，造成树势减弱，果实产量和品质明显下降。该病在陕西、山东等苹果主产区危害严重，如1999，2000和2002年该病害在陕西铜川大流行，平均病株率98%，病叶率84.2%，减产3%~30%(惠隽雄，2003)；2004年山东招远市90%以上的果园受害，发病面积达到1.5万hm²，平均病叶率高达76.6%，平均病情指数达81.7，9月下旬落叶率达到87%~100%，约有150 hm²果园因过早落叶而引起秋后再次开花(姜好胜等，2005)。

目前生产上主要采取生长季节连续喷施化学药剂防治苹果褐斑病，其效果因药剂种类和浓度、使用时间和次数、年份、地区、树龄、品种而异。因此，研究不同杀菌剂的毒力并结合田间不同施药关键时期研究来寻找适宜的防治药剂和方法、时期，具有实际意义和防治指导作用。但由于苹果褐斑病菌不易分离，且在人工培养基上难于培养，对其室内毒理方面缺乏研究报道，防治药剂的筛选和对比困难。本研究在筛选出适合该病菌生长的培养基和培养条件的基础上，以2种三唑类杀菌剂戊唑醇和苯醚甲环唑为主，进行其对病原菌生长发育的毒力研究，并结合田间防治试验，明确其防治原理、功效和防治关键时期，为彻底解决苹果生产中褐斑病的防治提供理论指导。

1 材料与方法 1.1 供试药剂

戊唑醇(25%奥宁可湿性粉剂)，云大科技股份有限公司，或43%好力克悬浮剂(田间试验用)，先正达(苏州)作物保护有限公司；苯醚甲环唑(10%世高水分散粒剂)，先正达(苏州)作物保护有限公司；十二烷基苄基二甲基氯化铵(10%杀菌优水剂)，西安近代农药科技股份有限公司；嘧菌酯(25%阿米西达悬浮剂)，先正达(苏州)作物保护有限公司。

1.2 供试菌种及其繁殖

苹果褐斑病菌分离株M8-12由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室提供，在YDA培养基(本实验室研制)上繁殖保存，取培养1个月的菌落加无菌水研磨，制成菌悬液备用。

1.3 室内毒力测定 1.3.1 分生孢子萌发

采用含药介质法。在1%水琼脂中混入5个不同浓度梯度的药剂，以不加药剂为对照。用无菌水将田间自然发病的病叶上的分生孢子冲洗后制成孢子悬浮液(浓度约为1×10⁵个·mL^-1)，取10 μL滴于Φ＝6 mm的含药琼脂块上，每处理3个重复。25 ℃保湿黑暗培养12 h统计萌发率，计算抑制率。

1.3.2 菌丝生长

采用液培法。在50 mL YD(不加琼脂的YDA)培养液中分别混入5个不同浓度梯度的药剂，以不加药剂的YD为对照，各加入1 mL菌悬液，每处理3个重复，22 ℃振荡培养(100 r·min^-1)14 d后用滤纸过滤，80 ℃烘干称量菌丝干重，计算抑制率。

1.3.3 分生孢子盘形成

采用含药介质法。将5个浓度梯度的药剂(表 4)与CSA培养基(本实验室研制)混合制成载药平板，以不加药剂的CSA为对照，各加入100 μL菌悬液，用三角玻棒涂布均匀，每处理3个重复。25 ℃黑暗培养10 d后在实体解剖镜下统计每视野(16×1)形成的菌落数和分生孢子盘的数量，每皿统计10个视野，计算分生孢子盘的产生率和不同浓度药剂对其抑制率。

1.4 田间药剂筛选试验

2005年和2006年试验地设在陕西省蒲城县罕井镇，品种为富士，树龄10年。4种药剂处理和1个空白对照，每处理4棵树，从东、西、南、北、中5个方向各固定2个枝条。分别于施药前后统计叶片数、严重度(病斑面积)，计算病叶率、病情指数和相对防效。

1) 施药前未发病或发病较轻用其计算。

2) 施药前已有一定程度的发病用其计算。

苹果褐斑病病害分级标准：1级：代表值0，叶面无病斑；2级：代表值1，病斑面积占叶面积的10%以下；3级：代表值3，病斑面积占叶面积的11%~25%；4级：代表值5，病斑面积占叶面积的26%~40%或叶片50%发黄；5级：代表值7，病斑面积占叶面积的41%~65%或叶片50%~90%发黄；6级：代表值9，病斑面积占叶面积的66%以上或叶片90%以上发黄。

1.5 喷药次数对苹果褐斑病防治效果的影响

2006年供试的4种药剂各设置喷1，2和3次药3个处理，以喷清水为对照(图 4)，每处理4棵树，调查和统计计算方法同1.4。

1.6 数据分析

以试验设置的系列浓度的对数值为X，其抑制率对应的机率值为Y，应用SAS8.0软件进行一元线性回归并根据所得方程计算EC₅₀。

2 结果与分析 2.1 室内毒力测定 2.1.1 对苹果褐斑病菌分生孢子萌发的影响

苹果褐斑病菌分生孢子在25 ℃保湿暗培养12 h萌发产生长度大于孢子的芽管(图 1)，但在药剂中的萌发实验结果(表 1)表明，在供试浓度范围内戊唑醇和苯醚甲环唑对分生孢子萌发率均有不同程度的抑制作用。戊唑醇在供试最高浓度500 μg·mL^-1时的抑制率高达96.42%，而苯醚甲环唑在供试最高浓度400 μg·mL^-1时的抑制率只有50.67%。

通过系列浓度的对数与抑制率对应的机率值求得回归方程及致死中浓度(表 2)，戊唑醇对分生孢子萌发的EC₅₀值为128.825 μg·mL^-1，苯醚甲环唑为331.131 μg·mL^-1。可见2种内吸性杀菌剂中戊唑醇对苹果褐斑病菌分生孢子萌发的抑制作用比苯醚甲环唑强。

2.1.2 对菌丝生长的影响

液体培养基培养菌丝体的测定结果(表 3)表明：在供试浓度范围内，2种杀菌剂对病原菌菌丝生长都有不同程度的抑制作用。戊唑醇在供试最高浓度0.12 μg·mL^-1时对菌丝生长的抑制率达到75.25%，而苯醚甲环唑在供试最高浓度0.032 μg·mL^-1时抑制率为93.40%，效果优于戊唑醇。从表 2可知戊唑醇、苯醚甲环唑对苹果褐斑病菌菌丝生长的EC₅₀值分别为0.06和0.009 μg·mL^-1，说明苯醚甲环唑对苹果褐斑病菌菌丝生长的抑制作用强于戊唑醇。

2.1.3 对分生孢子盘形成的影响

苹果褐斑病菌在CSA平板上培养10 d后可以形成明显的分生孢子盘(图 2)。从培养基上分生孢子盘的数量统计结果(表 4)可以看出：2种杀菌剂在供试浓度范围内对其形成均有一定的抑制作用。戊唑醇在供试最高浓度0.1 μg·mL^-1时抑制率达到63.92%，苯醚甲环唑在供试最高浓度0.04 μg·mL^-1时的抑制率为67.71%。从表 1可以看出：戊唑醇、苯醚甲环唑对病菌分生孢子盘产生的EC₅₀值分别为0.055和0.024 μg·mL^-1，说明苯醚甲环唑对分生孢子盘产生的抑制作用略优于戊唑醇。

从以上毒力测定结果综合分析：戊唑醇和苯醚甲环唑对苹果褐斑病菌的作用主要表现为对菌丝生长和分生孢子盘形成的抑制，对分生孢子的萌发抑制效果较差。其中戊唑醇除对分生孢子萌发的效果优于苯醚甲环唑外，对菌丝生长和分生孢子盘形成的抑制作用均比苯醚甲环唑差。因此，戊唑醇在田间较适于在侵染初期和发病初期喷施。根据苯醚甲环唑对病菌不同发育阶段的EC₅₀值来看，其对褐斑病菌的抑制效果优于戊唑醇。

2.2 田间防治试验

田间防治试验以2种试验药剂为主，以生产中常规使用的及新药剂为对照进行比较研究，发现2种药剂均有明显的防病效果(表 5，6)，病叶率和病情指数均明显低于未处理对照，但防治效果之间也存在显著差异。从表 5可以看出：戊唑醇的不同剂型防病效果虽有差异但并未达到显著水平，而苯醚甲环唑的防治效果明显较差。2006年的防治试验结果再次表明(表 6)：2种供试药剂在供试浓度均有明显的防病效果，表现为病叶率、病情指数明显低于未处理对照和十二烷基苄基二甲基氯化铵，但与新杀菌剂嘧菌酯存在一定差异。

从2年的田间试验结果可知：戊唑醇的防病效果虽然与剂型有关，但比苯醚甲环唑效果好，且与新杀菌剂嘧菌酯防病效果相当，明显优于十二烷基苄基二甲基氯化铵。

研究结果显示：喷药次数对不同药剂的防病效果影响不同。从防治效果(图 3)可知：喷施次数由1次增加到3次并未明显提高戊唑醇和嘧菌酯对病害的防治效果，说明施药时间可能是关键。但不同药剂在不同使用次数间防治效果差异很大，如十二烷基苄基二甲基氯化铵和苯醚甲环唑则随着喷药次数的增加，防效增高。病叶率(图 4)结果相似。这些结果说明第1次喷药的时间可能是该地区防治苹果褐斑病的关键时期，只要此时喷施1次内吸性杀菌剂，即可基本控制当年的病害，也说明此时可能是病菌侵染的主要时期。如果加喷1次，整个生长季节的防病效果会更理想。

3 讨论

从室内毒力测定的结果可知：戊唑醇和苯醚甲环唑对苹果褐斑病菌的抑制作用主要表现为对菌丝生长和繁殖体产生的抑制，对分生孢子的萌发抑制作用较差，表现为后者的EC₅₀值较前2者高10⁴~10⁵倍。2种药剂中，苯醚甲环唑对菌丝生长和繁殖体产生的EC₅₀值明显低于戊唑醇，说明其抑制作用较好；但戊唑醇对分生孢子的萌发的抑制作用较好，其EC₅₀值较苯醚甲环唑小近5倍。

与皿内试验结果有差异，戊唑醇在田间对苹果褐斑病的防治效果显著优于苯醚甲环唑，这与Sharma(2003)研究结果相似：三唑类杀菌剂氟喹唑和腈菌唑对苹果褐斑病的防效大于50%，苯醚甲环唑仅为28.71%。我们认为这可能与2者的使用浓度和剂型有关。本研究在田间使用的药剂浓度是按照建议使用浓度设计的，而并非根据毒力测定结果设计，如果按照毒力测定结果，苯醚甲环唑可能会优于戊唑醇，这有待于进一步的田间试验证明。尽管三唑类杀菌剂具有相似的作用机制，即抑制麦角甾醇的生物合成使菌体细胞膜功能受到破坏，但不同的三唑类杀菌剂在抵抗相同的病原菌方面也会表现出不同的抗菌活性和机制，从而防治效果间也会存在差异。如三唑酮可引起小麦条锈菌(Puccinia striiformis)胞间菌丝顶端的细胞壁不规则加厚，而烯唑醇不仅使菌丝顶端部位细胞壁增厚，而且可使整个菌丝细胞壁都同样加厚(康振生等，1996)。韩青梅等(2004)的研究表明：戊唑醇不仅可以使小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)的菌丝出现不规则肿胀，过度分枝，液泡化增加，菌丝细胞壁的不规则加厚，隔膜发育受阻，畸形、肿大，细胞质解体和坏死等与其他麦角甾醇生物合成抑制剂相似的变化，菌丝内出现电子透明的内含体和菌丝内产生子菌丝(菌丝套菌丝)现象。室内毒力测定结果表明戊唑醇相对苯醚甲环唑对病菌分生孢子萌发抑制作用较强，是否可以在一定程度上可以降低田间病菌分生孢子再侵染机率，因而在2年的田间试验中表现出的防效皆优于苯醚甲环唑。

比较供试的4种杀菌剂，可以看出2种三唑类杀菌剂在试验中均表现出优良的防效，在较低的施用浓度下(低于100 μg·mL^-1)就可以有效抑制苹果褐斑病的发生。但也有研究表明：在三唑类杀菌剂中氟喹唑和腈菌唑对苹果褐斑病的防效高于50%，苯醚甲环唑的防治效果仅有28.71%(Sharma，2003)，这可能与病菌的抗药性有关，因此进一步明确我国褐斑病菌对药剂的敏感性、病菌致病性分化等问题是非常必要的。

由西安近代农药科技股份有限公司研制，季铵盐类新型杀菌剂十二烷基苄基二甲基氯化铵，具有强极性，可以吸附在病原菌表面，破坏菌体细胞膜，影响其呼吸及糖酵解过程，使其窒息从而达到杀灭病原菌的目的(刘大勋等，2006)，对苹果斑点落叶病(李丙智等，2002)和苹果树早期落叶病(安孟林等，2005)有较好的防效，可以作为替换用药。

在日本已经发现对甲基托布津产生抗性的苹果褐斑病菌菌株(Tanaka et al., 2000)，因此对于该病害防治药剂的选择尽量避免单一的作用方式。对于在试验中防效较好的戊唑醇，极易产生抗性的植物病原菌对该药剂产生抗性的风险中等(Damicone，2004)。因此在2006年的田间药效试验中添加嘧菌酯。该药剂在田间与戊唑醇表现出同样优良防病效果，属甲氧基丙烯酸酯类化合物，通过抑制病原菌线粒体的呼吸作用，破坏其能量合成，且对苯并咪唑类产生抗药性的菌株有效(刘长令，2005)。时春喜(2004)的田间试验结果表明该药剂对苹果白粉病(Podosphaera leucotricha)、苹果斑点落叶病和苹果黑星病同样具有显著的防治效果，且与多菌灵和戊唑醇混用表现出较好的增效作用。建议交互使用戊唑醇和嘧菌酯，既可以有效控制苹果褐斑病的发生，防止抗药性的产生又可以兼治其他的苹果病害。

关于药剂安全性，43%戊唑醇在苹果上施药剂量3 000倍(143.3 μg·mL^-1)，施药3次，28 d间隔期是安全的(陈莉等，2007)。本试验中该药剂的施用浓度、喷施次数和最后的施药时间皆在安全范围内。嘧菌酯对陕西果树种植区的多数苹果主栽品种安全，但在较低施用浓度下(100 μg·mL^-1)对“嘎啦"可以产生严重的药害，造成果树大量落叶(时春喜，2004)，因此要根据栽培品种选择施用。

另外，根据本研究和Sharma(2003)的研究结果，建议在病害发生初期即6月中旬左右(陕西关中地区)喷施内吸性杀菌剂，既可以有效控制病害发生，又可以减少田间再侵染的概率，更加经济有效。同时，建议冬季清园以减少越冬菌源，进而降低来年初侵染的概率；及时合理的剪枝，促进果园内空气流通，减缓病害的扩展(Jones et al., 1997)。