季节性氮素贮藏是树木氮代谢的显著特征，对树木的生长、开花结果及抗逆性等方面都具有重要意义。20世纪80年代中期以来，人们发现贮藏氮化物的主要形式是专门的贮藏蛋白质，并称之为营养贮藏蛋白质(vegetative storage protein，简称VSP)(田维敏等，1999；2003；彭方仁等，2001)。这种蛋白质通常在夏末秋初开始积累，整个越冬期间维持较高的含量，春季随着新梢的萌发，贮藏蛋白质被降解成氨基酸以满足枝条生长的养分需求(Staswick，1994)。贮藏蛋白质的存在不仅防止了养分的损失，而且也为树木在新生长季的生长发育提供了必需的养分储备。营养贮藏蛋白质的细胞学研究是深入研究树木营养贮藏蛋白质的基础(田维敏等，2001)。银杏(Ginkgo biloba)是中生代遗留下来的孑遗植物，也是我国特有的集果用、材用、叶用及园林绿化为一体的多用途经济树种。对银杏营养贮藏蛋白质的超微结构特征及其动态变化已有报道(郭娟等，2002)，但有关银杏营养贮藏蛋白质的具体组分及其定位的研究报道很少(郭红彦等，2006)。本文利用SDS-PAGE对银杏枝条的营养贮藏蛋白质进行了研究，以期筛选出营养贮藏蛋白质的组分，并对其年动态变化进行分析，从而揭示银杏营养贮藏蛋白质的形成和积累规律，为研究营养贮藏蛋白质的积累和降解的调控机制打基础。

1 材料与方法 1.1 样品采集与处理

试验材料选自南京林业大学树木园内成年银杏雄株的当年生和2年生枝条。在2005年1月—2006年2月采样。在休眠期及快速生长期，即11月到翌年2月，每月采样1次；在其内部代谢旺盛时期，即活动期向休眠转化时期和芽萌发及新梢生长初期，每隔7 d采样1次。

1.2 可溶性蛋白质的提取

采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取可溶性蛋白质。

1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

采用BIO-RAD mini垂直板电泳槽进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。上样量20 μg。分离胶浓度15%，浓缩胶浓度4.4%。样品提取液(含2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝的0.01 mol·L^-1Tris-HCl，pH8.0)。用0.25%的考马斯亮蓝染色液染色2.5 h，脱色，直到背景脱干净为止。

1.4 电镜样品的制作与观察

电镜样品的制作参照郭娟等(2002)的方法。

2 结果与分析 2.1 银杏不同部位营养贮藏蛋白质的电泳分析

利用BIO-RAD Quality one软件分析银杏枝条不同部位的考马斯亮蓝染色图谱，发现了不同分子质量的营养贮藏蛋白质组分，且具有一定的年动态变化规律(图 1~4)。

2.1.1 银杏当年生枝条树皮中营养贮藏蛋白质的图谱

不同时期银杏当年生枝条树皮中蛋白质组分不同。当年生枝条树皮中有6种相对含量高的可溶性蛋白质，分子质量分别为36，32，28，23，18和15 ku，其中36和32 ku 2种分子质量的蛋白质具有明显的变化规律(图 1)，其动态变化可以分为降解(2—4月)(图 1中2~7)和积累(5—12月)(图 1中8~18)2个阶段。5月份新生叶片形成后，当年生枝条中即开始积累营养贮藏蛋白质，随着季节的变化，积累量逐渐增加，至12月份36和32 ku 2种分子质量的蛋白质含量达到最高(图 1中8~18)。在萌芽前1月和2月份这2种分子质量的蛋白质含量保持稳定(图 1中1，2)，3月中旬开始降解，含量逐渐减少(图 1中3~6)，到4月8日完全降解(图 1中7)。23，18和15 ku分子质量的蛋白质似乎也有类似的变化规律，但蛋白质谱带比较模糊，不是很清晰(图 1)。

2.1.2 银杏当年生枝条木质部中营养贮藏蛋白质的图谱

当年生枝条木质部中出现的蛋白质与当年生枝树皮中的蛋白质组分相同，36和32 ku分子质量的蛋白质变化规律与树皮中的也基本一致(图 2)。各种蛋白质的含量普遍低于树皮中对应蛋白质的含量(图 2中1~5)。

2.1.3 银杏2年生枝条树皮中营养贮藏蛋白质的图谱

2年生枝条树皮中主要的蛋白质种类与当年生枝条树皮中相同，36和32 ku的蛋白质谱带变化规律仍然非常明显，动态变化规律与当年生枝条大体一致(图 3)。不同的是，蛋白质组分谱带颜色浅于当年生枝条树皮，而且贮藏蛋白质降解期要晚于当年生树皮中的这2种蛋白质，于3月下旬谱带颜色明显变浅(图 3中4~5)，直到6月下旬其中的贮藏蛋白质才被完全降解(图 3中9)，7月中旬开始积累(图 3中10)，积累期晚于当年生枝条树皮，此后稳定增长，到12月达到最大(图 3中18)，在萌芽前维持稳定(图 3中1~2)。23和15 ku分子质量的蛋白质也有类似的规律性变化，但谱带颜色不是很清晰(图 3)。

2.1.4 银杏2年生枝条木质部中营养贮藏蛋白质的图谱

2年生枝条木质部中蛋白质种类与2年生枝条树皮中的蛋白质组分相同，36和32 ku呈现一致的变化规律(图 4)，但各种蛋白质组分谱带颜色都明显比当年生枝条中的蛋白质谱带浅(图 4中1~2)。在本图谱中36和32 ku的积累高峰出现在2月份(图 4中2)，而不再是12月份(图 4中18)，并且蛋白质开始积累的时间推迟至7月份(图 4中10)。其中23 ku蛋白质在整个年周期中始终存在(图 4中1~12)，没有明显的变化规律。18 ku蛋白质组分仅在1月份和2月份存在(图 4中1~2)。15 ku蛋白质有一定的变化，但没有明显的变化规律(图 4)。

2.2 银杏营养贮藏蛋白质的细胞学观察

对银杏当年生枝条贮藏组织进行细胞学观察发现，营养贮藏蛋白质以不同形态主要在细胞的液泡中积累，并存在明显的季节动态变化规律，可以分为积累(5—12月)和降解(3—4月)2个阶段(图版Ⅰ)。

图版说明Explanation of plate

标尺Bars:5 μm(1, 3); 2.5 μm(2); 10 μm(4, 5, 6, 7, 8). S.淀粉粒Starch grain；Pr.蛋白质Protein；Ph.韧皮薄壁细胞Phloem parenchyma cell；Rc.射线细胞Ray cell；Sp.圆球体Spherosome；Tp.液泡膜Tonoplast；N.细胞核Nucleus；W.细胞壁Wall；Piw.质膜内陷Plasmalemma invagination；Gi.高尔基体Golgi apparatus；V.液泡Vacuole；Va.小泡Vesicle；Er.内质网Endoplasmic reticulum；M.线粒体Mitochondria.

1-4.银杏枝条VSPs积累期的横切面电镜照片. 1.稀疏的絮状蛋白质分布于液泡中(5月12日); 2.颗粒状蛋白质沿液泡膜内缘沉积(10月14日); 3.颗粒状蛋白质聚集成不定形块状蛋白质，分布于液泡中央(10月31日); 4.颗粒状蛋白质集结于大小液泡中(12月8日)。5-8.银杏枝条VSPs降解期的横切面电镜照片. 5.聚集成圆球状的蛋白质慢慢降解成细沙状(3月18日); 6.不定形块状蛋白质向液泡膜方向移动，团块变小(3月26日); 7.蛋白质逐渐降解成稀疏絮状，出现线粒体、高尔基体和内质网(3月26日); 8.液泡蛋白质大量降解，未降解的蛋白质沿液泡膜分布(4月8日)。

1-4. Electron micrographs of branches of G. biloba in cross-section during VSPs accumulation stage. 1. Proteins of floccular form distribute in the vacuole on May 12；2. Proteins of granular form accumulate along the tonoplast on Oct.14；3. Proteins of granular form aggregate gradually and distribute in the center of vacuole in the form of irregular nubbly on Oct. 31；4. Proteins of granular form accumulate in the big and small vacuole on Dec. 8. 5-8. Electron micrographs of branches of G. biloba in cross-section during VSPs degradation stage. 5. Proteins degrade gradually from the spherical form into sand form on Mar.18；6. Proteins of irregular nubbly form move to the tonoplast and the shape becomes small on Mar. 26；7. Proteins degrade into floccular form proteins, appearing the mitochondria, Golgi apparatus and endoplasmic reticulum on Mar. 26；8. Proteins largely degrade, and protein undegraded distribute along the tonoplast on Apr. 8.

2.2.1 银杏营养贮藏蛋白质的积累

银杏营养贮藏蛋白质在新生叶子形成后即开始积累。5月份，新叶形成后，已经有稀疏的絮状贮藏蛋白质分布于液泡内(图版Ⅰ-1)。随着季节的推移，10月份大量颗粒状蛋白质沿液泡膜内缘沉积(图版Ⅰ-2)，彼此靠近，融合，聚集成电子密度更大的不定形块状，分布于液泡中央(图版Ⅰ-3)。到12月份贮藏蛋白质几乎充满整个液泡，只留少许空隙(图版Ⅰ-4)，至2月份保持稳定。

2.2.2 银杏营养贮藏蛋白质的降解

春季，随着芽的萌发和新生叶的展开，贮藏蛋白质逐渐减少。3月份薄壁细胞中液泡内聚集成圆球状的蛋白质缓慢降解成细沙状或稀疏絮状，通过小泡向液泡膜外运输(图版Ⅰ-5)；不定形块状蛋白质从液泡中央向液泡膜方向移动，团块变小(图版Ⅰ-6)。线粒体的出现为贮藏蛋白质的降解提供能量，高尔基体和内质网充当降解物的运输工具(图版Ⅰ-7)。至4月上旬，贮藏蛋白质几乎全部降解，未降解的蛋白质沿液泡膜分布(图版Ⅰ-8)。

3 结论与讨论 3.1 营养贮藏蛋白质的确定

Clausen和Apel曾为树木营养贮藏蛋白质制订了3条标准：1)积累在液泡中；2)在贮藏组织的可溶性蛋白质中相对含量高；3)有明显的季节变化，在休眠季节大量积累，树木重新生长后消失(Clausen et al., 1991；Staswick, 1994)。本文根据3条标准，结合SDS-PAGE图谱分析和细胞学观察结果(郭娟等，2002)，落叶期银杏枝条树皮和木质部中存在相对含量高的2种可溶性蛋白质，分子质量分别为32和36 ku，春季随着芽的萌发，积累在枝条中的这2种蛋白质明显消失；这2种蛋白质与细胞中的液泡蛋白质内含物的分布和变化一致，说明这2种蛋白质是液泡蛋白质内含物的主要成分。符合营养贮藏蛋白质的变化规律(Han et al., 2007)，因此，32和36 ku 2种分子质量的蛋白质应当是银杏的营养贮藏蛋白质。有研究者认为银杏的营养贮藏蛋白质组分是40和45 ku 2种分子质量的蛋白质(Shim et al., 1985)。对此作者进一步采用免疫组织化学定位，确定了32和36 ku 2种分子质量的蛋白质存在于细胞的液泡中(待发表)，证明32和36 ku 2种分子质量的蛋白质是银杏的营养贮藏蛋白质组分。关于银杏营养贮藏蛋白质的组分本文与前人的结论不一致，这可能与不同生态环境下生长的银杏特性有关。

3.2 营养贮藏蛋白质在植株中的分布

银杏营养贮藏蛋白质主要分布在枝条的树皮和木质部中，当年生枝条含量高于2年生枝条，树皮的含量高于木质部，这与大叶桃花心木(Swietenia macrophylla)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)等树木的营养贮藏蛋白质主要分布在次生维管组织，尤其是次生韧皮部的结论(田维敏等，2001；陈月异等，2007；Tian et al., 2002)一致，这可能是树木营养贮藏蛋白质分布的一般特点(田维敏等，2003)。

3.3 营养贮藏蛋白质的动用

银杏枝条的营养贮藏蛋白质在整个冬季都维持着稳定的含量，春季随着芽的萌发，枝条32和36 ku 2种分子质量的营养贮藏蛋白质含量明显减少，降解成小分子质量的蛋白质或者转化成氨基酸提供能量来满足新梢生长的需要，4月上旬这2种营养贮藏蛋白质完全消失。银杏当年生枝条营养贮藏的消失与芽的萌发及新梢的生长是同步的。枝条中的氮或专门的贮藏蛋白质的含量随着新梢生长而减少已被证明(郭娟等，2002；Tian et al., 2007；Wu et al., 1991；Coleman et al., 1993)。田维敏等(1999)在大叶桃花心木上的环剥试验也印证了这一点，环剥阻碍了新梢利用小枝中的贮藏蛋白质，从而导致新梢生长受到抑制。

银杏当年生枝条32和36 ku 2种分子质量的营养贮藏蛋白质降解时间比2年生枝条早，树皮中的这2种分子质量的营养贮藏蛋白质降解时间均早于木质部，这充分说明当年生枝条树皮的营养贮藏蛋白质在芽萌发和新梢生长时被优先利用，为芽萌发和正常抽新梢就近提供充足的氮素，也说明营养贮藏蛋白质对树木重新生长发挥着重要作用(彭方仁等，2001；郭娟等，2002；田维敏等，2002；2003；Coleman et al., 1994；Peng et al., 2004)。

3.4 营养贮藏蛋白质的积累

有关温带树木营养贮藏蛋白质的研究，以往得出的结论是，秋季的低温和短日照是诱导营养贮藏蛋白质积累的重要因子，因此营养贮藏蛋白质通常在秋季开始积累(田维敏等，2003)。本文发现，5月份随着新生叶的形成，32和36 ku这2种分子质量的营养贮藏蛋白质在银杏新梢中就已经开始少量积累，树木生长期这2种蛋白质的含量稳步增加，秋季落叶期氮素回运，枝条中的这2种营养贮藏蛋白质迅速积累，并于12月份含量达到最大值，可见，在新梢正在生长时，银杏就开始积累营养贮藏蛋白质了，与低温、短日照和生长停止并无直接关系。这一结论与杨树(Populus canadensis)、大叶桃花心木非常相似(Tian et al., 2005；田维敏等，2003；1999)。因此，新梢早期就开始积累营养贮藏蛋白质是温带和热带树木的一个共同特点，这对于树木的氮素代谢和生长发育可能具有重要的调控作用(田维敏等，2003)。