2009, Vol. 45
文章信息
- 岳红妮, 吴云锋, 史英姿.
- Yue Hongni, Wu Yunfeng, Shi Yingzi
- 泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白基因序列分析与蛋白结构预测
- Sequence Analysis and Structure Prediction of Antigenetic Membrane Protein Gene from Paulownia Witches'-Broom Phytoplasma
- 林业科学, 2009, 45(2): 147-151.
- Scientia Silvae Sinicae, 2009, 45(2): 147-151.
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文章历史
- 收稿日期：2008-01-06
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作者相关文章
泡桐(Paulownia spp.)原产中国，栽培历史悠久。其自然分布或栽培区遍布全国23个省(市)、自治区，北起辽宁，南至广东、广西、云南南部，东起台湾及沿海诸省，西至甘肃。泡桐丛枝病又名泡桐扫帚病，由泡桐丛枝植原体(Paulownia witches'-broom phytoplasma，PaWB)侵染引起，严重地区发病率达80%以上，是泡桐生产上最重要的病害之一。据1990年统计，全国泡桐丛枝病发生面积达88万hm2，直接造成的经济损失过亿元(蒋建平，1990)。
由于泡桐丛枝植原体无细胞壁，植原体膜蛋白直接接触寄主植物和昆虫细胞，因此推测植原体膜蛋白在寄主与植原体互作过程中可能起到了重要的作用(Shigeyuki et al., 2001)。Lee等(1993)报道我国台湾省的泡桐丛枝植原体的16S rDNA基因片段，史英姿等(2007)对我国陕西泡桐丛枝植原体(PaWB-shaanxi)16S rDNA基因和tuf基因的序列进行报道外，国内对泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白基因尚无研究。本研究对泡桐丛枝植原体的抗原膜蛋白基因(Antigenic membrane protein，Amp)克隆与测序，并对其基因序列和编码蛋白的结构特征进行分析，为进一步在分子水平上研究泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白的功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料泡桐丛枝病样采自陕西杨凌西北农林科技大学植物病理学实验站，保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。感病样品均通过16Sr DNA和tuf基因检测为阳性。对照健株由本实验室提供。Taq DNA聚合酶购自北京MBI公司，H.Q. & .Q.凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒为优晶生物工程有限公司产品，pMD 18-Tsimple vector购自TaKaRa(大连)生物有限公司，DL-2000 Marker购自北京东胜公司，E. coli JM109菌株为本室保存。
1.2 病株总DNA提取与amp基因扩增病株和健康对照总DNA参照顾沛雯等(2005)的方法并略有改动。CTAB法提取，具体方法根据GenBank中公布的翠菊黄化(Aster Yellows，AY)植原体、洋葱黄化(Onion Yellows，OY)植原体以及泡桐丛枝(Paulownia witches'-broom，PaWB)植原体日本分离物的免疫膜蛋白基因序列(GenBank accession Nos.：AF244540、AB110271、AB124810)两侧保守区设计引物。引物序列如下：amp-F：5-ATGCAAAATCAAAAAACTCAAA-3；amp-R：5-TTTATTTTTTTTGTTTTT TTTA-3。由北京赛百盛公司合成。PCR反应体系为25 μL：含有1×PCR Buffer，0.2 mmol·L-1 dNTPs，1.5 mmol·L-1 MgCl2，0.5 μmol·L-1引物对，1 U Taq酶(MBI)，30 ng模板DNA。反应循环为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次；最后72 ℃终止补偿延伸10 min。取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲体系中电泳后，经EB染色后在紫外灯下观察。
1.3 PCR产物纯化、克隆及序列测定扩增DNA靶片段采用H.Q. & .Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，纯化的PCR产物与pMD18-T simple vector 4 ℃过夜连接，采用CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp+和半乳糖苷酶的底物X-gal进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落-PCR和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒由上海英俊生物技术有限公司测序。
1.4 amp基因序列同源性分析和结构预测利用蛋白分析软件ANTHEPROT5.0对PaWB-Shaanxi抗原膜蛋白(Amp)理化特征进行分析，预测二级结构。利用网站(http://www.predictprotein.com)对PaWB-Shaanxi抗原膜蛋白(Amp)跨膜区以及潜在信号肽切割位点也进行分析预测。利用DNAStar软件包的EditSeq程序分析克隆基因的序列，寻找最大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，并将ORF转换成氨基酸序列。在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对核苷酸序列进行BLASTx分析，以推测ORF的正确性。用DNAMAN 5.2.2软件将克隆的基因序列和推测的氨基酸序列与AY、PaWB-Japan、OY、SPWB、AP、WX、PD和PYLR 8种植原体的序列进行系统进化树分析。
2 结果与分析 2.1 PCR扩增结果利用引物对amp-F/amp-R对泡桐丛枝病病株总DNA进行PCR扩增，电泳结果表明：以照片左侧的分子量标记为对照，感病泡桐材料扩增得到约700 bp左右的特异性条带，而健康对照未出现扩增带(图 1)。
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图 1 泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白amp基因PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplification of amp gene from PaWB M：DL-2000分子标准DL-2000 DNA marker；1、2：感病泡桐Paulownia infected with PaWB；3：健康泡桐Healthy paulownia. |
经序列测定，PaWB-Shaanxi的amp基因全长696 bp(GenBank accession No.：EU383017)，GC含量为32.5%。应用软件DNAstar对测定的核苷酸序列进行翻译，并将翻译得到的氨基酸序列登录GenBank进行比对，结果表明：该基因共编码231个氨基酸，产物是抗原膜蛋白基因。对泡桐丛枝-陕西株系(PaWB-Shaanxi)、翠菊黄化(AY)和洋葱黄化(OY)植原体免疫抗原膜蛋白amp基因核苷酸序列进行比较(图 2)，同源性达97%。PaWB-Shaanxi比AY和OY的核苷酸序列少6个碱基，PaWB-Shaanxi与AY有27个核苷酸的差异，与OY有28个核苷酸的差异，变异最大的区域在563~569 nt，其中有6个碱基为PaWB-Shaanxi比AY和OY缺少的部分。
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图 2 泡桐丛枝-陕西株系(PaWB-Shaanxi)、翠菊黄化(AY)和洋葱黄化(OY)植原体抗原膜蛋白amp基因核苷酸序列比对 Figure 2 Alignment of nucleotide sequence of amp gene among phytoplasmas from PaWB-Shaanxi, AY and OY |
对9种植原体免疫膜蛋白基因序列进行同源性分析，结果表明：PaWB-Shaanxi和PaWB-Japan植原体抗原膜蛋白基因的核苷酸序列同源率达到100%；同16Sr Ⅰ-B组内OY和AY的核苷酸序列同源率高达97%；而与16Sr Ⅲ组内WX植原体免疫膜蛋白基因的核苷酸序列同源率则较低，只能达到37%。说明不同组间植原体的免疫膜蛋白基因核苷酸序列变异较大，而同组内变异相对较小。利用DNAMAN 5.2.2软件对9种植原体免疫膜蛋白基因核苷酸和氨基酸序列进行系统进化树分析结果表明(图 3A和B)：在同一16Sr Ⅰ组中，PaWB-Shaanxi和PaWB-Japan植原体的免疫膜蛋白基因的核苷酸和编码的氨基酸序列进化距离相等；其次PaWB、OY和AY间的进化距离比较近；而两者与其他不同组的植原体进化距离均较远。系统进化树图中各分枝的长短表示它们的进化距离，也就是说分枝越长者所经历的进化阶段越长，与其他的亲缘关系越远。可见PaWB-Shaanxi和PaWB-Japan、OY和AY的进化距离较短，亲缘关系较近，其免疫膜蛋白可能属于同一类型。
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图 3 基于9种植原体株系amp/Imp基因片段核苷酸(A)和氨基酸(B)序列分析的系统发育树状图 Figure 3 Dendrogram obtained by analysis of amp/Imp gene nucleotide (A) and amino acid(B) sequences from nine phytoplasma strains |
利用蛋白分析软件ANTHEPROT5.0对PaWB-Shaanxi抗原膜蛋白(Amp)进行分析，结果表明：该蛋白的分子量为24.7 ku，等电点PI为9.935。理化特征曲线(包括：抗原性曲线Antigenicity profile，亲水曲线Hydrophilicity profile，疏水曲线Hydrophobicity profile，跨膜区域曲线transmembranous regions profile和易溶性曲线Solvent accessibility profile)分析显示该蛋白具有良好的抗原性，是一种两端疏水、中部亲水的跨膜蛋白(图 4)。通过软件ANTHEPROT5.0(Gibrat参数)对蛋白的二级结构进行预测，获得蛋白质的二级结构图，结果表明该蛋白主要是螺旋，占73%，其他结构为折叠、无规则卷曲，分别占11%、16%，二级结构中没有转角(图 5)。
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图 4 Antheprot 5.0对Amp物理化学特性分析 Figure 4 The physical and chemical properties analysis of Amp by Antheprot 5.0 |
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图 5 Antheprot 5.0对Amp二级结构预测结果 Figure 5 The secondary structure forecast analysis of Amp by Antheprot 5.0 |
通过Antheprot5.0计算，得到Amp的跨膜区曲线(图 6)。结果表明：Amp具有2个跨膜区，分别位于第14~31和第202~219个氨基酸残基。对潜在信号肽切割位点计算表明：切割位点分别位于蛋白的前端和末端，其中末端的第219个氨基酸残基(甘氨酸)处为最强切割位点，第22个氨基酸残基(丙氨酸)和第214个氨基酸残基(丙氨酸)处也存在较强的切割位点。在该蛋白的中部未发现潜在的信号肽切割位点(图 7)。
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图 6 Antheprot 5.0对amp跨膜区预测结果 Figure 6 The transmember regeion forecast analysis of Amp by Antheprot 5.0 |
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图 7 Antheprot 5.0对amp潜在信号肽断裂位点预测结果 Figure 7 The potential cleavage site of signal peptide forecast of Amp by Antheprot 5.0 |
本试验从泡桐丛枝植原体中国陕西株系PaWB-Shaanxi中克隆了抗原膜蛋白amp基因，PaWB-Shaanxi株系与已发表的PaWB-Japan株系抗原膜蛋白基因核苷酸序列同源性达100%，与16SrⅠ-B组内OY和AY的免疫膜蛋白核苷酸序列同源率高达97%，推测其可能具有相似的结构。
通过对PaWB-Shaanxi的抗原膜蛋白进行分析，得到Amp具有2个跨膜区，分别位于第14~31和第202~219个氨基酸残基处；并且存在有多个潜在信号肽切割位点，分别位于蛋白的前端和末端，在该蛋白的中部未发现潜在的信号肽切割位点。由于强的信号肽切割位点对原核表达的融合蛋白有很大的影响，因此位于蛋白末端的第219个氨基酸残基处的强信号肽切割位点可能会影响该蛋白全序列的表达。
在用原核表达系统对Amp蛋白进行表达的过程中，先后分别用pGEX-4T-1、pBV221、pET30a和pET32a等原核表达载体进行免疫膜蛋白全长基因表达质粒的构建，成功构建各种载体重组质粒，但在诱导表达过程中，各个构建载体的蛋白质产物中均未检测到相应的表达蛋白。Shigeyuki等(2004)在对洋葱黄化植原体Amp蛋白表达过程中也出现过全基因无法表达的情况，据此我们尝试切除C端的跨膜区进行蛋白的表达，但经转化诱导后，也未检测到相应表达蛋白。这可能与植原体的膜蛋白对大肠杆菌具有毒性有关，在先前的报道中已有证据显示植原体的膜蛋白对大肠杆菌具有毒性(Barbara et al., 2002)。
植物致病植原体没有细胞壁，其分泌的蛋白直接接触寄主植物和昆虫细胞，这暗示蛋白在寄主与植原体互作过程中可能起到重要的作用。分析推测免疫膜蛋白的结构及其理化性质，为研究该蛋白的功能奠定理论基础，为进一步研究寄主与植原体的互作提供有力的证据。
蒋建平. 1990. 泡桐栽培学. 北京: 中国林业出版社.
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顾沛雯, 安凤秋, 吴云锋, 等. 2005. 小麦蓝矮病植原体16S rDNA基因片段的比较分析. 植物病理学报, (5): 403-409. DOI:10.3321/j.issn:0412-0914.2005.05.004 |
史英姿, 吴云锋, 顾沛雯, 等. 2007. 泡桐丛枝植原体16S rDNA和延伸因子基因序列分析. 微生物学通报, 34(2): 291-295. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2007.02.022 |
Shigeyuki Kakizawa, Kenro Oshima, Tsutomu kuboyama, et al. 2001. Cloning and expression analysis of phytoplasma protein translocation genes. MPMI, 14(9): 1043-1050. DOI:10.1094/MPMI.2001.14.9.1043 |
Lee I M, Hammond R W, Davis R E, et al. 1993. Universal amplification and analysis of pathogen 16SrDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. Phytopathology, 83: 834-842. DOI:10.1094/Phyto-83-834 |
Shigeyuki Kakizawa, Kenro Oshima, Hisashi Nishigawa, et al. 2004. Secretion of immunodominant embrane protein from onion yellows phytoplasma through the Sec protein-translocation system in Escherichia coli. Microbiology, 150: 135-142. DOI:10.1099/mic.0.26521-0 |
Barbara D J, Morton A, Clark M F, et al. 2002. Immunodominant membrane proteins from two phytoplasmas in the aster yellows clade (chlorante aster yellows and clover phyllody) are highly divergent in the major hydrophilic region. Microbiology, 148: 157-167. DOI:10.1099/00221287-148-1-157 |
Morton A, Davies D L, Blomquist C L, et al. 2003. Characterization of homologues of the apple proliferation immunodominant membrane protein gene from three related phytoplasmas. Mol plant pathol, 4: 109-114. DOI:10.1046/j.1364-3703.2003.00155.x |
Berg M, Davies D L, Clark M F, et al. 1999. Isolation of the gene encoding an immunodominant membrane protein of apple proliferation phytoplasma and expression and characterization of the gene product. Microbiology, 9(145): 1937-1943. |
Blomquist C L, Barbara D J, Davies D L, et al. 2001. An immunodominant membrane protein gene from the Western X-disease phytoplasma is distinct from those of other phytoplasmas. Microbiology, 147: 571-580. DOI:10.1099/00221287-147-3-571 |