银海枣(Phoenix sylveseris)褐斑病由病原真菌链格孢刺葵专化型(Alternaria alternata f. sp. phoenix)引起，该病最初发现于沙特阿拉伯(Sheir et al., 1982)，近年则在中国华南地区发现危害严重。受害植株先是在羽片上产生褐色或红褐色小斑点，然后病斑逐渐向叶轴扩展，呈椭圆形或不规则的长椭圆形，黑褐色至黑色，在发生严重的部位病斑常连接成片，叶轴褪绿变黄，羽片干枯，严重影响银海枣的正常生长及观赏价值。

目前对于银海枣褐斑病的研究较少，主要涉及病原鉴定、症状描述及化学防治试验等(Sheir et al., 1982; Abdusalam et al., 1992; 孙思等, 2005; 2006)。接种试验表明，链格孢刺葵专化型只能从伤口侵入，不能对完好无伤的银海枣叶片进行成功侵染。这一现象不同于其他链格孢－寄主病理系统中的直接侵入(Betro et al., 1999)或气孔侵入(Blodgett et al., 2002)。

伤口是许多病原菌侵入植物的一个理想途径，因为植物表皮破坏后失去了抵抗病原菌入侵的机械屏障，同时伤口释放的某些物质有可能成为微生物运动或生长的导向。然而，针对伤口如何启动侵染的机制，目前研究还比较少。

本研究的目的是探讨链格孢刺葵专化型在侵染寄主的过程中是否存在病原真菌对寄主的趋向性生长，同时该趋向性生长对于寄主与非寄主是否存在特异性，并由此推断寄主与病原菌之间是否有识别事件发生。通过一系列的接种试验和显微观察，得到了下列病菌侵入前有关寄主病原互作的新信息。

1 材料与方法 1.1 菌种、植物和生长条件

链格孢菌株GZFC-01从广州染病的银海枣上分离得到。病原菌置于25 ℃恒温黑暗培养。7~8 d后，用无菌水振荡洗涤菌落得到孢子悬浮液，并稀释至终1×10⁵·mL^-1分生孢子用于接种，供试棕榈科植物包括银海枣，加拿利海枣(P. canariensis)，桄榔(Arenga pinnata)，短穗鱼尾葵(Caryota mitis)和棕竹(Rhapis excelsa)，由华南农业大学园林中心提供。

1.2 植物接种

采集健康的上述植物叶片，清水冲洗，用75%酒精表面消毒，无菌水冲洗，然后用下列3种不同方式分别接种：1)刺伤以后立即接种；2)刺伤以后分别间隔24，48，72 h再接种；3)用蘸取桄榔叶片汁液的针刺伤银海枣后接种，同时用蘸取银海枣叶片汁液的针刺伤桄榔后接种。接种方法为喷洒1×10⁵·mL^-1分生孢子的悬浮液于叶片表面。无伤接种为对照。将接种后的叶片保湿10 h后取出，多数叶片切为1 cm×1 cm的方块，使每1个方块中心有1个伤口；剩余叶片继续保湿7 d，观察症状发展。

1.3 接种叶片标本的固定和制片

将经上述步骤得到的叶片方块置入75%乳酸4~5 d，直至植物组织变得透明，然后用1%苯胺蓝染色20 min，漂洗(方中达, 1998)。将叶片方块制片后在光镜(Olympus BH-2)下观察。

1.4 趋向性测定

在均衡的叶面环境下，孢子萌发产生芽管的生长方向应该是随机分布，如果按常规的4个方位，即上、下、左、右统计，各生长方向的几率理论值应该均为25%。如果芽管向某一个方向延伸的几率超过或低于25%，则表明有趋向性反应，此时叶面环境并不完全均衡。在本研究中，设定叶片伤口处于上述4个方位之一，因此链格孢刺葵专化型孢子芽管对该伤口是否存在趋向性可由只向该伤口方向延伸的芽管数与萌发芽管总数的比值来判定。如比值超过25%越多，则趋向性越强，具体的强弱标准用5个区间值来表示：高于60%，强趋向性；45%~60%，中等趋向性；30%~45%，弱趋向性；20%~30%，零或无趋向性；低于20%，负趋向性。每个处理共设20个叶片方块的重复。

在计数时，只对生长方向清晰可辨的芽管进行统计；如果芽管过度扭曲变形，生长方向无法辨认时则不统计在内。同时为测定趋向性的作用距离，将距伤口左边或右边的区域分为500 μm以内，501~1 000 μm和1 001~1 500 μm 3部分，将其中芽管的趋向性分别计算。如果一个芽管横跨2个或以上计数区域，则将其计入芽管顶端所在区域。

1.5 病原菌的植物汁液培养

分别取参试植物叶片10 g，清洗切碎后，置于30 mL蒸馏水中煮沸10 min，纱布过滤，将过滤所得汁液定容至50 mL后用0.45 μm微孔滤膜过滤灭菌。打取带菌丝的PDA小圆片(Ф=5 mm)接种至各植物汁液中，在25 ℃下振荡培养(100 r·m^-1)96 h后，取出菌落烘干至恒质量后称量。马铃薯葡萄糖液体培养基为正对照，灭菌蒸馏水为负对照。

2 结果与分析 2.1 症状观察

刺伤接种的银海枣和加拿利海枣在第3天即开始出现褐色病斑，在短穗鱼尾葵、桄榔和棕竹上，则7天后也没有产生症状。据此，短穗鱼尾葵、桄榔和棕竹初步判定为非寄主。刺伤后间隔不同时间接种的各种植物叶片，除了间隔24 h接种的银海枣叶片发病以外，其他时间间隔和植物叶片都未发病。

2.2 病原菌的趋向性生长

无伤接种结果显示，在所有植物的叶片上，分生孢子萌发产生的芽管都只是随机向各个方向伸长，没有明显的趋向性。孢子可形成球形至不规则形的附着孢，但没有主动穿透表皮，或从气孔侵入的行为。刺伤接种结果显示真菌芽管在银海枣叶片上有强趋向性：在距伤口500 μm范围内，大约80%的芽管趋向伤口方向生长。在加拿利海枣上的结果近似，超过60%的芽管趋向伤口方向生长。但在桄榔和短穗鱼尾葵上芽管只显示非常微弱的趋向性，稍大于30%(表 1)。此外，在棕竹叶片上的孢子芽管大都因为卷曲而无法计数。

2.3 距离对趋向性的影响

距离对芽管趋向性的影响十分明显，随着距离的增加，趋向性不断减弱。病原真菌在银海枣等寄主叶片上距伤口500 μm范围内显示较强趋向性；当距离超过1 000 μm时，趋向性急剧下降至微弱甚至为零(表 1)。

2.4 刺伤与接种之间的时间间隔对趋向性的影响

刺伤后立即接种和间隔24, 48和72 h后再分别接种所得的趋向性强度显著不同。在银海枣和加拿利海枣上，刺伤后立即接种的趋向性分别为79.65%和63.19%(表 1)，均为强趋向性。但随着接种间隔时间的增加，趋向性急剧下降，即使只间隔24 h接种，趋向性也由强降至中等甚至弱趋向性(表 2)。

2.5 携带异种植物汁液刺伤对趋向性的影响

试验结果表明，链格孢刺葵专化型对含有非寄主桄榔汁液的银海枣伤口的趋向性减弱了15%；相反，链格孢刺葵专化型对含有寄主银海枣汁液的桄榔伤口的趋向性增加了30%(图 1)。

2.6 植物汁液培养

链格孢刺葵专化型在各种植物汁液中的生长状况差异显著，在银海枣和加拿利海枣汁液中，链格孢刺葵专化型的生长状况甚至超过马铃薯葡萄糖液体培养基。与之相反，链格孢刺葵专化型在棕竹和短穗鱼尾葵汁液中的生长量极少，甚至没有生长，在桄榔汁液中只有中等的生长量(图 2)。

3 结论与讨论

某种病原物具有的趋向潜在寄主移动或生长的能力，可以大大增加其成功接触寄主的机会。许多微生物都具有此类趋向性反应，如一些寄主产生的化合物可诱导休眠状态的真菌发芽、生长(Mitchell, 1976)。然而，除了个别真菌的菌核显示可被寄主分泌物促进发芽，而在非寄主上很少甚至不发芽以外，没有证据显示微生物对寄主植物的趋向性生长存在明显的特异性(Coley-Smith, 1976)，而且，多年来，在针对侵入前阶段寄主与病原互作的研究中，也少有关于趋向性在寄主识别病原时所起作用的新信息报道。

在本试验中，笔者第一次证明孢子芽管对于植物的趋向性生长具有明显的特异性。病菌孢子对其天然寄主银海枣和接种寄主加拿利海枣的新鲜伤口具有强烈的趋向性生长，而对非寄主植物则不具或仅有微弱的趋向性生长。这一现象强烈地揭示了寄主伤口可能释放某些特异物质以吸引病菌向其生长，趋向性可能是向化性；而链格孢刺葵专化型的趋向性与其成功识别寄主之间存在着关联，链格孢刺葵专化型对寄主特异性的趋向性生长应该是该病理系统中寄主病原识别的第一事件。识别行为在病原菌侵入寄主以前已经开始发生，这有利于帮助病原菌寻找侵入寄主的途径和增加侵染的成功率。

本试验中无伤接种所有参试植物都没有成功，说明链格孢刺葵专化型必须通过伤口才能启动侵染，而且必须是新鲜伤口。经过24 h或更长时间的伤口逐渐失去了对孢子芽管的吸引力，相应的侵染成功率也逐渐下降，甚至失败。如银海枣的伤口经过24 h后，吸引力就降低了40%，48 h后则基本丧失了全部吸引力。由此表明病菌的趋向性对伤口的新鲜程度十分敏感。对于旧伤口吸引力减弱甚至丧失的原因目前还不十分清楚，伤口自愈可能是原因之一，这一现象在黄瓜(Cucumis sativus)(Walter et al., 1990)和其他一些植物(Shackel et al., 1991)上曾有过报道。

刺伤以后24 h再接种不成功的试验结果，与旧伤口失去吸引力的结果相一致，进一步表明链格孢刺葵专化型对新鲜伤口的趋向性对其成功侵染寄主的重要性。同时，由于真菌的趋向性随着其孢子与伤口距离的增加而减弱，可以预见当孢子与伤口相距较近时其侵染成功的机会较大，而当距离超过1 000 μm或更远时，侵染成功的机会微小。

当在植物叶片伤口中加入另一种植物的汁液后，病原真菌的趋向性受到明显影响。带有非寄主汁液的寄主伤口吸引力下降，而带有寄主汁液的非寄主伤口吸引力增强，这一点也表明寄主伤口释放物质与趋向性及其强弱有关。寄主与非寄主在吸引病原趋向性生长方面的区别可能源于它们伤口释放的物质的成分不同。本试验证实链格孢刺葵专化型在寄主与非寄主汁液中有显著不同的生长量，从一个侧面揭示寄主与非寄主植物物质成分的不同与病原真菌的识别侵染可能有关。植物伤口挥发性物质包括萜类化合物、倍半萜烯和脂肪酸等，它们被发现对昆虫和一些真菌有吸引力(Bolter et al., 1997; Carlile et al., 1988;Chowdhery et al., 1986)，但本试验中植物上是否存在这些或其它挥发性物质以及其作用仍需要进一步研究证实。