雷公藤(Tripterygium wilfordii)为卫矛科(Celastraceae)雷公藤属植物，为主要杀虫植物之一，我国民间很早以前就将雷公藤用于防治各种害虫(Swingle et al., 1941；Luo et al., 2004；李琰等，2008)。同时，它又是一种重要的药用植物，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒、抗肿瘤、抗风湿的作用(王恒邦等，2007；朱国福等，2007)。但由于雷公藤为多年生木质藤本，生长缓慢，医药临床和无公害农业生产上的大量应用，造成野生资源严重不足。植物离体培养和植株再生体系的建立是基因工程育种的重要工作(曾黎辉等，2002)。通过愈伤组织再生途径出现无性系变异是植物组织培养过程中普遍存在的现象(李晓玲等，2008)。对植物体细胞无性系的细胞、再生植株及其后代的研究表明，在这些变异中，有不少变异是对植物性状改良有益的，并且可以稳定遗传，因此，在植物育种上有广泛的应用(韦彦余等，2004；孙振元等，2005)。然而，目前对雷公藤等卫矛科植物的研究主要集中在播种繁殖、组培快繁(吴琰等，2007；龙祥友等，2007；王茂良等，2004；马艳等，2004)等方面，关于雷公藤组织培养再生植株的研究未见报道，因此有必要对雷公藤组织培养再生体系的建立进行系统研究。本研究以雷公藤胚性愈伤组织为材料，研究继代培养时间对植株再生和基本培养基、生长素浓度及其与细胞分裂素组合对再生苗增殖的影响，以期为雷公藤通过愈伤组织途径培育无性系变异新品种在理论与实践方面提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从福建省泰宁地区采集生长良好的雷公藤单株1年生枝条，扦插于杨凌温室苗床上，新长出的幼茎高度达10 cm时，嫩叶及幼茎用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2 h，70%酒精消毒20 s，无菌水冲洗4次，1 g·L^-1 HgCl₂消毒4 min，无菌水冲洗4次。剪取带腋芽的茎段用作外植体进行腋芽诱导研究。叶切成0.5 cm×0.5 cm方块接种在MS+1.0 mg·L^-1 2, 4-D+0.5 mg·L^-1 KT培养基上，25~30 d后形成愈伤组织。愈伤组织在同样培养基上连续培养3代，形成的胚性愈伤组织备用。胚性愈伤组织在MS+1.0 mg·L^-1 2, 4-D+0.5 mg·L^-1 KT培养基上，继代保存，30 d继代1次。

1.2 试验方法 1.2.1 基本培养基对腋芽诱导和生长的影响

选用MS、1/2MS(大量元素减半)、1/4MS(大量元素为MS的1/4)、B₅、H、WPM 6种基本培养基，均添加1.0 mg·L^-1 IBA。每个处理接种40瓶，每瓶接种1个带腋芽的茎段。培养30 d后，调查萌芽外植体数、腋芽个数、节间长度，计算萌芽率，萌芽率=萌芽外植体数×100/(接种外植体数-污染外植体数)。

1.2.2 雷公藤胚性愈伤组织植株再生及其稳定性试验

以MS为基本培养基添加0.1 mg·L^-1NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA，研究培养时间对雷公藤胚性愈伤组织植株再生的影响。将培养愈伤组织转接在不同植物生长调节剂组合的培养基上，进行胚性愈伤组织分化潜力丧失研究。每个处理接种30瓶，每瓶接种3块胚性愈伤组织。培养30 d后，调查发芽愈伤组织块数、每块愈伤组织平均形成芽个数，并计算分化率，分化率=分化愈伤组织块数×100/接种愈伤组织块数。

1.2.3 雷公藤芽苗的增殖

以雷公藤胚性愈伤组织再生形成的5种小苗和直接由芽诱导形成的小苗为材料，在MS、1/2MS、1/4MS、B₅、H、WPM 6种培养基上，添加2.0 mg·L^-1 IBA，研究基本培养基对雷公藤芽苗继代增殖的影响。在1/2MS培养基上添加不同浓度的IBA、NAA，研究不同生长素浓度对腋芽萌芽和生长的影响；在附加2.0 mg·L^-1 IBA的1/2MS培养基上添加不同浓度的6-BA和KT，研究生长素与细胞分裂素组合对雷公藤芽苗继代增殖的影响。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，培养50 d后，调查萌芽率、芽苗高度、生根率等指标。

1.2.4 活性炭添加量对芽苗生根的影响

胚性愈伤组织形成的小苗，继代培养3代以后，在附加2.0 mg·L^-1 IBA的1/4MS培养基上，添加不同浓度的活性炭，研究活性炭对芽苗生根的影响。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，培养50 d后，调查生根数、根生长情况，计算生根率。

所用培养基，加入蔗糖30 g·L^-1，用琼脂7 g·L^-1固化，pH调至5.8，在温度(25±2)℃，光照每天12 h，光照强度为1 000~1 500 lx的培养室培养。

2 结果与分析 2.1 基本培养基对雷公藤腋芽萌发和生长的影响

由表 1可知，各种培养基中腋芽的萌发率均在90%以上，但芽苗的生长情况差异较大。中等浓度无机盐的1/2MS、H培养基不仅有利于腋芽的萌发和芽的生长，萌芽率达100%，且芽苗的节间较长，适合进一步继代培养。高浓度无机盐的MS培养基上形成的芽苗，叶色深绿，生长旺盛，但芽苗节间较短，不利于进一步继代培养。高硝酸钾的B₅培养基上形成的芽苗，叶色深绿，生长过旺，芽苗节间过长，也不利于进一步继代培养。而低无机盐浓度的1/4MS、WPM培养基中，腋芽萌发后生长缓慢，叶片较小。

2.2 继代培养时间对雷公藤胚性愈伤组织植株再生及胚性愈伤组织分化能力的影响

雷公藤胚性愈伤组织在MS附加NAA 0.1 mg·L^-1+6-BA 1.0 mg·L^-1培养基上，继代后第5天开始膨大，第20天后，愈伤组织逐渐变绿，出现芽点，1个月后芽苗形成。从第3代开始有芽分化，随着继代次数的增加，分化率逐渐升高。8~12个月之间分化率达100%，每块愈伤组织分化出的芽苗数达18个左右，且分化出的小苗叶色深绿，生长健壮。继代培养1年以后，胚性愈伤组织逐渐变得疏松，分化率和每块愈伤组织上形成的芽数也逐渐下降(表 2)，愈伤组织膨大明显，分化出的小苗畸形率升高。继代培养第18个月的愈伤组织膨大后期逐渐转绿，仅个别愈伤组织上长出1~2个畸形苗后，便逐渐枯死，20个月后已完全丧失了分化能力。

雷公藤胚性愈伤组织在继代培养20个月后，转接在MS附加0.05 mg·L^-1 NAA；0.1 mg·L^-1 NAA；0.5 mg·L^-1 NAA；0.5 mg·L^-1 6-BA；1.0 mg·L^-1 6-BA；2.0 mg·L^-1 6-BA；0.05 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA；0.1 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA；0.2 mg·L^-1 NAA+2.0 mg·L^-1 6-BA；0.5 mg·L^-1 NAA+5.0 mg·L^-1 6-BA的培养基上，进行不同植物生长调节剂组合条件下，雷公藤胚性愈伤组织分化潜力丧失研究。试图通过激素调控胚性愈伤组织分化能力的挽救，各种处理的培养基上均没有芽分化。可见，雷公藤胚性愈伤组织继代20个月后已丧失分化能力。

2.3 雷公藤胚性愈伤组织再生植株变异及其稳定性

在添加了0.1 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA的MS培养基上，在8个月到1年之间，雷公藤愈伤组织分化率接近100%，小苗生长健壮。分化形成的小苗从叶形上看，有以下6种类型：第1种(图版Ⅰ-1)叶形为长卵形，叶缘有粗锯齿；第2种(图版Ⅰ-2)叶形为披针形，叶缘有细锯齿；第3种(图版Ⅰ-3)叶形为阔椭圆形，叶缘全缘；第4种(图版Ⅰ-4)叶形为长卵形，叶缘有细锯齿；第5种(图版Ⅰ-5)叶形为披针形，叶缘全缘；第6种为直接由芽诱导形成的植株(图版Ⅰ-6)，叶形为阔卵形，叶缘有细锯齿。经过多代继代培养后，愈伤组织再生植株叶形和叶缘与刚分化出的小苗相比性状稳定，分化出的小苗(图版Ⅰ-1)生长旺盛，茎杆粗壮，叶色深绿。

2.4 雷公藤芽苗的增殖 2.4.1 基本培养基对雷公藤芽苗继代增殖的影响

各种培养基上芽苗的萌发率均较高(表 3)，但芽苗的生长及生根情况差异较大。1/2MS、H培养基不仅芽苗生长较好，芽苗节间长度也较适合继代培养。MS和B₅培养基上形成的芽苗生长旺盛，尤其B₅培养基上芽苗生长过旺，茎段细弱，不易继代培养。1/4MS、WPM培养基中，虽然芽苗生根率较高，但单节间较短，芽苗生长缓慢。

2.4.2 IBA和NAA对腋芽萌芽和生长的影响

培养基中添加不同浓度的IBA后，不仅对芽苗的萌发及生长影响较大，对芽苗的生根影响也比较大(表 4)。在0.5~2.0 mg·L^-1之间，萌芽率高达100%，生根率及根的生长情况也随着浓度的升高而增加。IBA浓度为2.0 mg·L^-1时节间较长，适合进一步继代培养。IBA浓度为0.5 mg·L^-1时有丛芽形成但节间较短，不适合于继代培养。当IBA浓度为4.0 mg·L^-1时，对芽苗的生长影响不大，但明显影响了根的分化和生长。不加激素的培养基上，芽苗几乎没长，叶片卷曲，逐渐脱落。

NAA浓度在0.0~2.0 mg·L^-1之间，芽苗的萌发率、高度、节间长度、增殖系数、生根率，随着NAA浓度升高而增加(表 5)，但生长情况均不及加入相同浓度的IBA。当NAA浓度为4.0 mg·L^-1时芽苗的生长受到了抑制。

2.4.3 IBA与6-BA和KT配合使用对芽苗增殖的影响

由表 6可见，在IBA浓度为2.0 mg·L^-1时，加入不同浓度的6-BA和KT均不利于芽苗的生长，表现在萌发率、高度、节间长度、增殖系数、生根率均低于对照，随着浓度的增加，萌芽率、生根率等逐渐下降。KT的抑制作用较6-BA强，加入0.5 mg·L^-1KT，萌芽率、生根率就分别下降了20%和30%。

2.5 活性炭添加量对芽苗生根的影响

在生根培养基中，加入一定浓度的活性炭不仅提高了生根率，根的生长情况也明显好于对照(表 7)。当活性炭为0.5 g·L^-1时，生根率达100%，根的生长发育状况也比较旺盛，因此，活性炭浓度为0.5 g·L^-1对芽苗生根最为有利。浓度超过0.5 g·L^-1，生根率、每株平均根数、苗的高度、生长情况，随着活性炭浓度的增加而降低。可能是因为活性炭有较强的吸附能力，吸附了培养基中的大量营养物质所致。

2.6 炼苗及移栽

在生根试管苗高6~8 cm时开始炼苗，首先将瓶口打开置温室散射光下光培炼苗2 d，取出小苗，用自来水洗净根部的琼脂，再用800倍25%多菌灵浸泡根部5 min，然后移栽至经高温灭菌的珍珠岩和腐殖质土(1:1)的营养杯中，用1/10 MS液浇灌，罩上塑料杯保湿。每星期浇1次多菌灵和1/10 MS液，10 d之后去掉塑料杯，生长25 d左右可带土移栽到田间，炼苗移栽成活率达到95%。

3 讨论

本研究中雷公藤胚性愈伤组织再生植株能力在继代中出现先逐渐增高，再降低，继代20个月以后丧失分化能力，继代培养中再生的植株叶型出现多种明显的变化，这反映了愈伤组织继代培养的不稳定性。体细胞胚再生能力的丧失是植物组织培养中一个主要的问题，在许多植物组织培养中随着愈伤组织中多倍体和非整倍体数量的增加导致其再生能力下降甚至丧失(张俊娥等，2006)。这种现象在陆地棉(Gossypium hirsutum)(王喆之等，1994)、柑橘(Citrus)(张俊娥等，2006)等胚性愈伤组织继代培养中也有类似的报道。随着愈伤组织继代次数的增加，多数基因型的愈伤组织再生植株能力下降，少数基因型的愈伤组织再生植株能力略有增加或一直保持在某一水平(Cai et al., 1990)。陈发菊等(2007)研究表明，在银鹊树(Tapiscia sinensis)胚性愈伤组织继代培养中分化能力下降与继代培养中形成大量多倍体及非整倍体细胞有关；黄素华等(2003)认为染色体数目变异是体细胞无性系变异的主要原因。有关雷公藤胚性愈伤组织长期继代培养中细胞变异的原因将有待于进一步研究。

虽然愈伤组织培养中体细胞无性系变异导致植株再生能力的下降，但这些变异大多数是可遗传的(陆柳英等，2007；李晓玲等，2008)，对于植物遗传改良来说，可作为变异的一种新来源(Sakhanokho，2001)。通过腋芽诱导的器官发生途径在幼苗性状上是稳定的，该途径保持了原材料的遗传稳定性。雷公藤胚性愈伤组织的再生植株叶形出现了各种变化，并且经过茎段增殖培养后，再生植株叶形和叶缘的变化可稳定地保留下来。再生植株出现的这种外形变异，其内在有效成分是否发生变化，通过进一步的研究可为筛选高含量活性成分的优系奠定基础。

活性炭对雷公藤芽苗生根具有明显的促进作用。本研究在生根培养基中加入活性炭，不仅可以促进雷公藤芽苗不定根产生，也可以促进根的生长，并且可抑制根褐变现象的发生。这在贾彩凤等(2006)等在华山松(Pinus armandii)不定根的生根培养中也得出了类似的结果。但袁秀云等(2007)在国槐(Sophora japonica)的生根培养中却发现活性炭对生根有一定的抑制作用。生根培养中，活性炭在培养基中具有提供黑暗环境和吸附物质的两方面作用。黑暗环境有利于植物生根和根系生长，还减少光诱发的培养基中IAA和IBA的降解(Nissen et al., 1990)。活性炭可以吸附培养材料产生的酚类物质，防止褐变现象的发生，提高了外植体的成活率与器官发生能力。活性炭还可以吸收和解吸附植物激素、糖类和金属粒子，这种非选择性吸附对培养材料可能会产生负作用，组织培养中鉴定活性炭的吸附与释放物质有助于理解活性炭在植物组织培养中对植物生长发育的作用。