林业科学  2008, Vol. 44 Issue (12): 163-167   PDF    
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魏建荣, 李淑梅, 陈丛梅, 魏红, 苏衍修, 杨忠岐, 李广武, 韩一凡.
Wei Jianrong, Li Shumei, Chen Chongmei, Wei Hong, Su Yanxiu, Yang Zhongqi, Li Guangwu, Han Yifan
转Bt基因健杨R-94对膜肩网蝽和2种潜叶蛾的抗性
Resistance of R-94 Bt-transgenic Poplar to Hegesidemus habrus (Heteroptera: Tingidae) and Two Leaf-miner Species
林业科学, 2008, 44(12): 163-167.
Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(12): 163-167.

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收稿日期:2008-03-25

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魏建荣
李淑梅
陈丛梅
魏红
苏衍修
杨忠岐
李广武
韩一凡

转Bt基因健杨R-94对膜肩网蝽和2种潜叶蛾的抗性
魏建荣1, 李淑梅2, 陈丛梅3, 魏红3, 苏衍修3, 杨忠岐1, 李广武1, 韩一凡2     
1. 国家林业局森林保护重点实验室 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091;
3. 河南省濮阳市林业科学研究所 濮阳 457000
关键词:转Bt基因健杨    抗虫性    膜肩网蝽    杨白潜叶蛾    柳细蛾    
Resistance of R-94 Bt-transgenic Poplar to Hegesidemus habrus (Heteroptera: Tingidae) and Two Leaf-miner Species
Wei Jianrong1, Li Shumei2, Chen Chongmei3, Wei Hong3, Su Yanxiu3, Yang Zhongqi1, Li Guangwu1, Han Yifan2     
1. Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF Beijing 100091;
2. Research Institute of Forestry, CAF Beijing 100091;
3. Puyang Research Institute of Forestry of Henan Province Puyang 457000
Abstract: There are many reports about resistance of transgenic Bt poplars to lepidopteran defoliators. Whether the poplars can resist haustellate mouth part pests and leaf-miners remains unclear. This study chose transgenic Bt poplar, Populus euramericana cv.Robusta'(R-94), as the material to investigate its resistance to a haustellate mouth part pest, Hegesidemus habrus, and two leaf-miner species, Leucoptera susinella (Lepidoptera: Lyonetiidae) and Lithocolletis paslorella(Lepidoptera: Gracillariidae) in both field and laboratory. Results showed that R-94 poplar had strong resistance to H. habrus in fields. Injury rates of R-94 leaves were respectively only 1.08% in pure stands and 1.1% in mixed stands respectively, while injury rate of 107 poplar (a non-transgenic variety) was 16.3% in the mixed stands. When H. habrus was fed with R-94 leaves in laboratory, the livability of nymphae was 19.9% after 7 days of feeding. However, the livability of nymphae reached to 56.8% after 7 days of feeding with leaves of 107 poplars. When H. habrus was fed with R-94 and 107 poplar leaves together, the insects significantly preferred 107 poplar leaves to R-94 poplar ones. Besides H. habrus, R-94 poplar also showed strong resistance to two leaf-miners species. Therefore, R-94 poplar not only has strong resistance to lepidopteran pest, but also has similar resistance to haustellate mouth part pests and leaf-miners.
Key words: Bt-transgenic R-94 poplar    insect resistance    Hegesidemus habrus    Leucoptera susinella    Lithocolletis paslorella    

杨树是我国北方的主要用材树种,不仅速生丰产,而且树冠高大,是优良的园林绿化和生态环境保护树种。近些年出于造纸业的需求,杨树在湖南、湖北等地也有大规模的种植。不过由于食叶和蛀干害虫的严重危害,杨树的大规模发展受到了一定的制约。1992年中国林业科学研究院林业研究所和中国科学院微生物研究所合作,从德国引进健杨(Populus euramericana cv. `Robusta')组培苗为外植体,将35S-Ω-Bt-NOS嵌合基因的双载体以农杆菌为介质导入健杨中,获得一批转化材料,通过分子生物学及生物学测定结果综合筛选出一批抗虫转化苗木,为防治多种杨树食叶性害虫开辟了新的途径(田颖川等,1993陈颖等, 1996李淑梅等,2008)。1997年、1999年2次通过农业部的安全审查,批准在新疆、北京、山东、吉林、江苏、河南和陕西6省市进行中试和环境释放。2002年进一步经过专家审查,同意进行商品化生产。中试结果表明,转Bt基因抗虫杨的抗虫性状稳定,对春尺蠖(Apocheima cinerarius)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)等鳞翅目害虫的抗性效果明显,能有效地控制这些害虫的危害,并且对土壤微生物和害虫天敌无不良影响(胡建军等,19992004卞大明等,1999张真等,2004),且在7年生的无性系中稳定存在(王军辉等,2004)。

近年来,在山东、江苏、河南等地发现半翅目的膜肩网蝽(Hegesidemus habrus)有危害加重的趋势,该虫在北京、河北、江西、湖北、四川、甘肃、陕西和山西也有分布,刺吸杨树叶片的叶汁,致使叶片变黑、卷曲、脱落,严重影响林木生长(赵俊芳,2006魏红等,2007)。为此,研究抗虫杨对刺吸式的非靶标害虫的抗性具有新的重要意义。有鉴于此,笔者在河南濮阳选择田间试验林,对转Bt基因健杨94(简称R-94杨)抗膜肩网蝽的情况进行了调查,同时对试验林中的杨白潜叶蛾(Leucoptera susinella)和柳细蛾(Lithocolletis paslorella)(肖刚柔, 1992)进行了调查。现将R-94杨对上述3种害虫的抗虫性评价报道如下。

1 材料与方法 1.1 试验林地概况

在河南省濮阳市林科所于2002年营造的杨树包括健杨94品种的比较林中,选择2块试验林地为样地。一块样地为R-94杨和107杨(P.×euamericana cv. `76/76')混合栽植,株距3 m×4 m,面积1 hm2,6年生,平均树高为15 m,郁闭度0.8;另一块试验样地为R-94杨纯林,面积0.4 hm2,6年生,树高15 m,郁闭度0.8。对供试的R-94杨做南方杂交印迹测定,结果显示呈阳性,表明含有所转入的Bt基因。

1.2 膜肩网蝽和杨潜叶蛾对R-94杨和107杨危害的调查

在2块样地中,采用对角线5点取样法,各标记5株R-94杨和107杨为样树,分别代表混交林抗虫杨和非抗虫杨,全年系统调查膜肩网蝽和杨潜叶蛾(杨白潜叶蛾和柳细蛾数量分别占91%和9%)危害的情况。每10 d调查1次,每次调查时,在每个样树东、南、西、北4个方向各随机截取1.0 m长的一段枝条,仔细清点叶片总数,分别统计受膜肩网蝽危害过的具有刺吸孔的叶片受害率(由于此虫受惊扰后,具有假死或逃逸习性,虫口数难以作为调查依据)与潜叶蛾造成的叶片受害率。

1.3 膜肩网蝽对R-94杨和107杨的选择试验

采用16 cm×23 cm的聚乙烯(PE)密封袋,并以昆虫针扎若干通气小孔,分2个处理分别在袋里放入从试验地采回并作清洁处理的R-94杨和107杨新鲜叶片,再接入采自野外的虫龄大小一致、虫体活跃的膜肩网蝽成虫。每处理各设3个重复,然后将饲养袋置于实验室的通风阴凉处,定期统计成虫的存活率。

另外,取6 cm×11.5 cm×17.5 cm的透明聚丙烯特制养虫盒,将清洁处理过的R-94杨和107杨的2种新鲜叶片等量混合后放入养虫盒内,接入试虫。养虫盒置于实验室内通风良好的阴凉处饲养,定时检查叶片的受害程度,分级统计2种树叶的受害情况。受害等级的标准为:Ⅰ级,轻微受害,受害的每个叶片有0~5个被害的刺孔;Ⅱ级,轻度受害,受害的每个叶片有6~20个刺孔;Ⅲ级,较重受害,受害的每个叶片有21~40个刺孔;Ⅳ级,严重受害,受害的每个叶片有41个以上刺孔。

1.4 数据分析

对于树冠不同方向受害程度的比较,先对受害率的数据(百分比)进行arcsine转换,然后利用Tukey法进行多重比较(One Way ANOVA,SPSS软件)。对于不同林分或品种间受害率的比较,方法同上。对于1.3中单独饲养时网蝽存活率数据的比较,则用相同的方法进行数据转换后,利用配对样本T检验进行比较。对于以2种树叶混合饲养膜肩网蝽的试验,分不同的受害级别对抗虫树种和对照树种上树叶上的刺孔数进行独立样本Mann-Whitney Test检验(非参数检验)。

2 结果与分析

通过观察,发现膜肩网蝽在河南1 a发生4代,世代交叉重叠,若虫成虫同时存在。现将膜肩网蝽及2种潜叶蛾对R-94杨与107杨的危害调查结果分述如下。

2.1 膜肩网蝽在树冠不同方向上的危害差异

利用多重比较法对树冠上东、南、西、北4个不同方向的受害率值进行分析。结果表明,在混交林中的R-94杨在不同方向间的差异不明显(图 1), 原因可能是因为受害率均较低,表现不出差异显著性。在R-94杨纯林中,4个方向上树叶的受害率也没有显著的差别(图 1),原因应与上相同。在混交林中,107杨树冠在4个方向的受害率有差异(Df=3, F=3.889, P=0.022),但主要在东方向和南方向上的受害率差异显著(Df=1, F=5.966, P=0.016),在其他方向上的差异不明显(图 1)。在南方向的受害率较高,可能与膜肩网蝽喜欢群集向阳有关。

图 1 膜肩网蝽对不同林分不同方向杨树叶片为害的比较 Figure 1 Comparision of injury rates of poplars leaves caused by H. habrus on different directions in different poplar stands 被害率为均值±标准误; 柱顶不同字母表示差异显著,P=0.045<0.05 Injury rates are average±SE; different letters on columns mean significantly different at P < 0.05.
2.2 膜肩网蝽对不同林分中R-94杨与107杨危害的差异性

在野外,膜肩网蝽对R-94杨纯林的危害率只有1.08%。在107杨与R-94杨的混交林中,膜肩网蝽对R-94杨的危害率也只有1.1%,但对107杨的危害率却达16.3%。无论是纯林还是混交林中的R-94杨与混交林中的107杨比较,均达显著差异水平(纯林:Df=1, F=64.99, P=0;混交林:Df=1, F=63.622, P=0)(图 2),即R-94杨对膜肩网蝽具有抗性。

图 2 膜肩网蝽和2种潜叶蛾在纯林、混交林中对2种杨树的为害差异 Figure 2 Injury rates caused by H. habrus and two leaf-miner species on two different poplar breed varieties in pure and mixed stands 柱顶不同字母表示差异显著,P<0.01 R-94: pure R-94 poplar stands; MR-94: R-94 poplar trees in mixed stands; M 107: 107 poplar trees in mixed stands; Different letters on columns mean significantly different at P < 0.01, Paired-sample T Test
2.3 杨潜叶蛾在不同林分中对R-94杨与107杨的危害

研究结果表明,杨潜叶蛾对纯林和混交林中R-94杨叶片的危害率远低于混交林中的107杨,2种林分中R-94杨的受害率与混交林中的107杨分别相比差异均显著(Df=1, F=34.493, P=0;Df=1, F=17.841, P=0.003)(图 2)。说明R-94杨对杨潜叶蛾也有一定的抗性。

2.4 膜肩网蝽对R-94杨和107杨的选择性及存活率

结果显示,单独利用107杨饲养的膜肩网蝽的存活率为56.8%,而利用R-94杨饲养的膜肩网蝽的存活率只有19.9%,2者差异显著(Df=4, t=3.974, P=0.016)。

在2种叶片共存时,R-94杨受到轻微危害的叶片明显比107杨多(图 3),2者差异显著(U=0, W=6, P=0.037<0.05);而R-94杨受到严重危害的叶片却远远少于107杨的叶片(U=0, W=6, P=0.034<0.05)。如图 3所示,随着受害级别的加深,107杨受害的叶片越来越多、R-94杨受害的叶片则趋于下降。观察中还发现膜肩网蝽均产卵于107杨叶片上,而未在R-94杨叶片上产卵。107杨和R-94杨共存时受害的图片比较见图 4,107杨叶片上的刺吸孔数远远多于R-94杨叶片上的刺孔数。

图 3 R-94杨与107杨共存时受膜肩网蝽的选择性为害比较 Figure 3 Number of attacked leaves of R-94 and 107 poplar by H. habrus respectively when supplied leaves of both breed varieties together. Ⅰ—Ⅳ:轻微、轻度、较重、严重;0~5, 6~20, 21~40, >41 piercing hole on every leaf respectively, mean±SE
图 4 R-94杨和107杨共存时受膜肩网蝽危害比较 Figure 4 Comparision of leaves between R-94 poplar and 107 poplar damaged by H. habrus when mixed two kinds of leaves together
3 讨论

转基因杨树一般是转Bt基因杨,由于其所表达的Bt毒素能够杀死植食性昆虫,所以近年来成为杨树育种的一个重要方向。目前转基因杨对于咀嚼式口器类的鳞翅目及鞘翅目植食性害虫的抗性已有较多的研究(郭同斌等,2004张冰玉等,20052006),但对于非靶标的刺吸式害虫的抗性研究非常少。本项研究表明,转基因健杨94对膜肩网蝽这类刺吸式口器的害虫也有较好的抗性。潜叶蛾是潜藏在叶肉中危害的昆虫,R-94抗虫杨对这类害虫也有较显著的抗性。因此推断,在刺吸式害虫和潜叶性害虫的发生区,适宜营造转Bt基因的R-94杨纯林或混交林来抑制这类害虫的大发生。

室内饲养试验的结果表明喂食R-94杨叶片的膜肩网蝽7 d后的存活率只有19.9%,而喂食作为对照的107杨叶片的个体基本正常,存活率达56.8%,这个结果基本与野外调查相吻合。另外,笔者观察到饲喂R-94杨的膜肩网蝽取食频次低,爬行时间多于取食时间,当寻找不到喜食的叶片时宁可饿死也不取食。但将膜肩网蝽投入到它们喜欢取食的107杨叶片上时,它们很快爬到叶背适宜的部位定居下来,而且多数喜欢群集昼夜取食,取食过程中一般也不转移,其行为活动表现如常。当用2种叶片共同饲喂膜肩网蝽时,发现大部分个体取食107杨叶片,只有个别个体取食R-94杨,但也会很快停食而转移到107杨叶片上。试验中还发现,膜肩网蝽在107杨叶片上有产卵现象,而在R-94杨叶片上不产卵,这充分说明R-94杨对膜肩网蝽有抗虫作用和拒食行为,主要原因可能与R-94杨叶液中含有转Bt基因的毒蛋白素有关。

转基因植物的生物安全性一直受到人们的关注,一些研究者认为转基因植物对害虫的天敌影响不大(Zwahlen et al., 2000; 李春宏等, 2004; 徐遥等, 2004; 高素红等, 2006),但也有关于对天敌有不良影响的报道(郭建英等, 2007),或在害虫不同的虫态、对于不同的天敌种类有不同的影响结果(Xiao et al., 2005; 孙长贵等, 2003)。

为了初步观察R-94杨对天敌的影响,笔者于2007年5月19日在R-94杨纯林及2种杨树的混交林中,随机选择10株杨树进行了天敌调查,结果均发现有多种害虫天敌,如捕食性天敌异色瓢虫(Harmonia axyridis)、龟纹瓢虫(Propylaea japonica)、中华草蛉(Chrysopa sinica)、猎蝽(Ectrychotes sp.)、食蚜蝇、蚂蚁、蜘蛛等,寄生性天敌茧蜂(Apanteles sp.)、姬蜂(Coccygomimus sp.)、寄蝇(Exorista sp.)等。并随机从混交林地中采集杨潜蛾有虫叶片40枚,带回室内饲养,羽化出黄色格姬小蜂(Pnigalio falvipes)和金纹细蛾跳小蜂(Holcotharax teftaceipes) 2种天敌,2种天敌的总寄生率为27.5%。这些结果初步说明转Bt基因R-94杨对害虫天敌的影响不大。不过,由于调查的时间不够长及调查的方法等问题,还很难说转基因抗虫杨是否对天敌有长期的影响(Lövei et al., 2005)。目前大面积推广R-94杨的工作处于初期阶段,今后还应对R-94杨与各种害虫的发生关系进行监测,并持续对该抗虫杨的抗性和安全性进行评价研究。

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