松材线虫病是一种通过媒介昆虫携带松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染松树而导致松树迅速死亡的一种毁灭性传染病害。人为调运未经处理或处理不彻底的感病原木、木材、薪材及包装箱等制品是病害扩散的主要原因。随着国际贸易往来和国内各地之间各种形式的交流日益频繁，松材线虫继续传入我国和在国内继续扩散的可能性越来越大。检疫是松材线虫病综合治理的一项非常重要的基础性措施。随着经济的迅速发展，生产上迫切需要准确快速的检疫检验技术。利用木屑有机提取溶液的显色方法进行快速检疫检验，快速、显色直观，检验工具及设备简单、经济，便于推广应用(王玉嬿等，2000；2001)。因其准确性和专化性达不到100%，只限于已知疫区的病死木和包装材料的初步检测，应用调运检疫有一定的局限性。酶学和血清学技术需要样品量大，结果易受线虫龄期和环境的影响，目前还没有成熟的技术用于松材线虫病的检疫检验。虽然分子生物学技术具有敏感性高、所需样品少、快速简便等优点，但由于需要昂贵的仪器设备和高层次的专业技术人员，目前在检疫实践工作中还未得到广泛应用(王明旭等，2004)。尽管形态分类尚存在一些缺陷，如有些形态特征不十分稳定，但目前还没有更成熟的方法取代它(杨宝君等，2003)。一些专家学者通过提高水温、改进分离器等方式缩短线虫分离时间，通过休眠幼虫的快速培养缩短形态学鉴定的时间，在一定程度上使松材线虫病检疫检验达到了快速、准确(宋玉双等，1992；周弘等，2001；2002；李一农等，2002)。疫木直接培养，不需要制作生物培养基质，但木材中营养缺乏，休眠幼虫成熟要3~4 d。单异活体培养，接种线虫36 h即有大量成虫出现，可以进行形态学鉴定；而生物培养基质的制作需要4~5 d(钟国强等，2004)。如何相互弥补不足，使形态学快速检疫检验更快速，在生产实际中容易操作、易于广泛推广应用的研究工作具有更加重要的意义。本研究利用冷藏的生物培养基质培养松材线虫L_Ⅲ幼虫开展试验，探索解决检疫实际工作中经常遇到的分离线虫量少或全部为L_Ⅲ幼虫，培养鉴定所需时间长的难题。

1 试验材料 1.1 供试样品

1) 样木的收集 利用贝尔曼漏斗法分离，立体显微镜和显微镜下镜检鉴定的方法从2003年2月至2004年11月采自广东、重庆、安徽和贵州等松材线虫病疫区的大量病木中，筛选出只感染松材线虫的病木6株和1块沙发板条作为样本。将只分离到休眠幼虫的样本放入冰箱4℃下冷藏，以保持松材线虫的休眠幼虫虫态。将有成虫的样本放在室内自然条件下，东北干燥炎热的夏秋季节使样本变得非常干燥，松材线虫为度过不良环境逐渐进入休眠阶段。不定期从样本上取样分离镜检，待样本中的松材线虫全部为休眠幼虫时，置于4℃冰箱中冷藏备用。2)样品的制备 从经过筛选只含有松材线虫休眠幼虫的样本中取样，劈成木条，用贝尔曼漏斗法分离松材线虫。用5 mL沉淀管接取分离液，自然沉淀收集松材线虫，用于冷藏真菌培养。收集的松材线虫休眠幼虫样品置于4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2 供试真菌

选用繁殖倍数较高的3种真菌(杨宝君等，2003)：沈阳农业大学植物线虫实验室提供的灰葡萄孢(B.cinerea)、中国林为科学研究院森林生态环境与保护研究所线虫室提供的盘多毛孢(Pestalotia sp.)和南开大学生命科学学院微生物系提供的镰刀孢(Fusarium sp.)。

1.3 仪器设备

本试验采用普通的实验仪器：西门子普通家用型冰箱、培养箱、立体显微镜和显微镜等。

2 研究方法 2.1 培养基质的制备

采用PDA培养基，在直径75 mm的培养皿中制成平板。在无菌条件下，将灰葡萄孢、盘多毛孢和镰刀孢分别接种到平板上培养。灰葡萄孢25 ℃、盘多毛孢和镰刀孢28 ℃培养4~5 d，待菌丝铺满平板表面后，置于4 ℃冰箱中冷藏备用。

2.2 松材线虫的接种培养

从冰箱中取出铺满真菌的培养皿和松材线虫样品，逐渐恢复至室温。将每个PDA平板菌丝层分别相对均等的分成10小块，用镊子夹取每1小块，菌丝层朝上置于直径50 mm小培养皿中。有菌条件下，用尖头滴管吸取未经任何处理松材线虫休眠幼虫悬液，分别等量地滴在18 mm×18 mm的盖玻片上1滴。解剖镜下数每张盖玻片上松材线虫的数量，使每张盖玻片上的线虫数量接近相等，数量控制在30~100条。显微镜下确认为L_Ⅲ幼虫后，用镊子夹取盖玻片，水滴面朝下接种到小培养皿中PDA平板菌丝层上，小培养皿中滴2滴水保湿，盖上培养皿，置于30 ℃或25 ℃培养箱中培养。

在不同的温度下，松材线虫的发育有差别。在30 ℃条件下，松材线虫生长最快，3天可完成1代；25 ℃条件下需要4~5 d完成1代。温度上升发育加快，但温度过高则发育不正常，繁殖受到抑制(杨宝君等，2003)。许多学者在用于接种试验的松材线虫培养中多采用25 ℃，基本不采用30 ℃。为达到快速检疫的目的，本试验培养温度主要采用30 ℃试验，而以25 ℃作参考，用来培养松材线虫的3种真菌灰葡萄孢、盘多毛孢和镰刀孢在30 ℃下每1菌种每1培养时间分别设14个重复；25 ℃下每1菌种每1培养时间分别设4个重复。

2.3 松材线虫发育成熟情况的观察

培养24，48和72 h后，分别从小培养皿中取出PDA菌丝层，连同盖玻片放入铺好纱布的漏斗中，夹上止水夹，缓缓加水适量，用镊子取出盖玻片，贝尔曼漏斗法分离。4 h后，用5 mL沉淀管接取漏斗底部分离液，沉淀0.5 h后，用滴管吸取沉淀管底部的线虫，制成临时玻片标本，显微镜下观察松材线虫的发育情况，记录每个重复中松材线虫的雌、雄成虫和幼虫的数量及新孵幼虫的有无。

2.4 统计与分析

统计同一温度下，同一菌种、相同培养时间的分散型3龄幼虫成虫率、有成虫样重复数、可以准确鉴定病原线虫种类的重复数和出现新孵幼虫的重复数，进而统计有成虫样率、鉴定率和新孵幼虫样率。成虫率是每一重复中观察到的雌、雄成虫之和与该重复中镜检出线虫总数的百分比；有成虫样率是有成虫出现的重复数与所设重复数的百分比；鉴定率是可以准确鉴定病原线虫种类的重复数与所设重复数的百分比；新孵幼虫样率是出现新孵幼虫的重复数与所设重复数的百分比。利用数理统计方法分析温度、菌种和培养时间对快速检疫检验的影响。

3 结果与分析 3.1 3种冷藏真菌在不同温度下培养松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率比较

灰葡萄孢、盘多毛孢和镰刀孢3种真菌在4 ℃冰箱中经过一定时间冷藏后，于25 ℃和30 ℃恒温条件下培养松材线虫L_Ⅲ幼虫，24，48和72 h后松材线虫的成虫率及各处理组合的平均成虫率见表 1。从表 1中可以看出：灰葡萄孢在30 ℃下培养松材线虫幼虫48和72 h的成虫率低于25 ℃，盘多毛孢和镰刀孢在30 ℃下培养松材线虫休眠幼虫每一培养时间的成虫率均高于25 ℃。

应用t检验对2种温度下每一个处理组合的平均成虫率进行统计检验(南京农业大学, 1988)，结果见表 2，所有处理组合的平均成虫率在25和30 ℃下差异均不显著，温度虽然对不同的菌种有影响，但对松材线虫L_Ⅲ幼虫的发育成熟没有显著影响。

3.2 冷藏真菌菌种和培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫成虫率影响的差异性分析

一定的成虫率是形态学鉴定的基础。以松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率为考核指标，分析比较菌种和培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响。3种冷藏真菌25 ℃下培养松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率随培养时间变化趋势如图 1a所示；30 ℃下培养松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率随培养时间变化趋势如图 1b所示。

利用表 1中的数据对冷藏真菌菌种和培养时间影响松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率进行双因素方差分析见表 3。F测验结果表明: 25 ℃下菌种间和培养时间间差异极显著，菌种和培养时间没有交互作用；30 ℃下菌种间和培养时间间差异极显著，同时菌种和培养时间有交互作用。

3.3 冷藏真菌菌种和培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫成虫率影响的差异性比较

通过方差分析在25和30 ℃下冷藏真菌菌种间和培养时间间差异均极显著，同时在30 ℃条件下冷藏菌种和培养时间有交互作用。采用新复极差测验进一步明确各个平均数之间的差异显著性。3种冷藏真菌对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响达到了差异显著，在25 ℃下只有镰刀孢和灰葡萄孢达到了差异极显著；在30 ℃下3种冷藏真菌之间的差异均达到了极显著，见表 4。

培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响在25 ℃下，72和48 h之间差异不显著，72，24 h及48，24 h之间差异达到极显著；在30 ℃下3个培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响差异达到了极显著，见表 5。在30 ℃下，菌种和培养时间的交互作用对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响见表 6。

3.4 冷藏真菌培养松材线虫L_Ⅲ幼虫对快速检疫检验的的影响

3种真菌不同温度、不同培养时间的鉴定率、有成虫样率和新孵幼虫样率见表 7。在有些重复中鉴定率低于有成虫样率，这是由于本试验为解决生产上分离线虫量少的难题，在保证对比试验一致的情况下线虫最低接种量只有30条；而受回收线虫数量的限制，在镜检时只见到雄成虫或雌成虫的缘故。从表 7可以看出样本的鉴定率、有成虫样率和新幼虫样率与前文分析的温度、菌种和培养时间对松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟的影响结果基本一致，在接种线虫量较少时，镰刀孢25 ℃下培养72 h，30 ℃下培养48和72 h，盘多毛孢30 ℃培养72 h，鉴定率均能达到100%。温度升高有利于镰刀孢和盘多毛孢促进松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟，不利于灰葡萄孢促进松材线虫L_Ⅲ幼虫发育成熟。经过冷藏的镰刀孢促进松材线虫幼虫发育成熟的作用最明显，盘多毛孢次之，灰葡萄孢最差。

4 结论与讨论

本试验的结果表明，25 ℃和30 ℃对松材线虫L_Ⅲ幼虫的发育成熟影响差异不显著。但灰葡萄孢属于低温真菌，在4 ℃冷藏条件下仍缓慢生长，不易保藏，25 ℃是它的最适合生长温度，30 ℃下促进松材线虫L_Ⅲ幼虫生长发育要比25 ℃差，灰葡萄孢不适宜作冷藏培养。镰刀孢和盘多毛孢在30 ℃下培养松材线虫L_Ⅲ幼虫的成虫率均高于25 ℃。镰刀孢30 ℃下培养48 h，25 ℃下培养72 h，即使只接种30条休眠幼虫也能达到100%的鉴定率，当线虫数量充足时，培养24 h即可进行形态学快速检疫检验。它是3种真菌冷藏后最适合用于松材线虫形态学快速鉴定的菌种。盘多毛孢冷藏后促松材线虫幼虫成熟的作用较镰刀孢略差，线虫样品充足时，培养时间48 h也可完成快速检验，如线虫量少可根据情况适当延长培养时间。无论在25 ℃还是在30 ℃条件下，在幼虫的培养过程中，真菌培养基质升温快而均匀，线虫发育相对整齐迅速，促进松材线虫幼虫成熟的作用明显优于疫木直接保湿培养(李海燕等，2008)。在试验过程中发现：培养24 h检验时，有很多松材线虫幼虫的阴门或交合刺已发育成形但还未蜕皮，只能记录为幼虫，培养48 h检验时，成虫率已很高；但为了使本试验的结果前后一致，培养时间间隔在本试验中未作变动。为加快检疫检验的速度可在今后的工作中于24和48 h之间设置一间隔进行试验。

镰刀孢是寄主植物的致病菌之一，松材线虫用于接种试验时不能采用它培养。但用于松材线虫检疫检验时完全可以采用它培养。曾有学者建议将多毛孢作为松材线虫形态鉴定的标准基质(赵文霞等，2005)。本试验的结果表明：冷藏后在镰刀孢菌丝层上，松材线虫分散型幼虫在30 ℃条件下发育成熟比在盘多毛孢菌丝层上迅速。因此，建议通过试验比较2个菌种对松材线虫尾尖突的影响，同时可以选择培养松材线虫繁殖倍数高的其他真菌，如长喙壳菌、毛壳菌、细基束梗孢菌(Cephalotrichum sp.)及黑孢菌等，作冷藏后培养松材线虫的试验，综合分析后筛选出进行形态学快速检疫检验的最佳培养基质。

选择冷藏真菌培养松材线虫休眠幼虫，缩短检疫检验时间是工作理念和思维方式的创新，基层检疫检查站和基层口岸检疫部门可以将培养基的制作和真菌培养这些无菌操作工作委托给大学或省级森防站和检疫站等单位。将培养好的PDA平板真菌基质放入数控式冰箱的4 ℃下冷藏，检疫人员在检疫实际工作中，一旦发现疑似松材线虫的幼虫，马上从冰箱中取出培养基质，无需对线虫进行消毒即可直接培养，线虫量多时，1 d即可完成种类鉴定，线虫量少时，2 d也能完成鉴定。可以通过追踪管理加速通关速度。但需要针对真菌冷藏时间对松材线虫分散型3龄幼虫的发育成熟的影响开展试验。

利用冷藏真菌培养松材线虫休眠幼虫进行松材线虫形态学快速检疫检验，没有原木pH显色反应快速，但准确率高，基本能达到100%；同时较分子生物学技术易于在基层推广应用。它不需要昂贵的仪器设备，复杂的试验程序，不菲的试验成本和高层次的专业技术人员；它采用的技术，普通的专业技术人员经过稍加培训即可掌握。它的广泛应用将使松材线虫病的检疫检验工作日常化，使松材线虫的准确鉴定由专家层面过渡到普通专业技术层面，对松材线虫病的检疫检验工作起到推进作用。