煤矸石为煤炭开采中燃点达不到要求的废弃部分，是煤炭生产的必然产物。在中国，煤矸石占原煤产量的15%~20%，每年平均排放量为2亿t左右。煤矸石的处理多以堆放为主，据1995统计，已累计占压土地22万hm²(苏光全等，1998)。煤矸石堆积形成的煤矸石山，因堆积方式及煤矸石所携带的能量，有不同程度的自燃现象(张振文等，2001)。常年自燃的煤矸石山，每平方米燃烧面积每天将向大气排放出CO 10.8 g，SO₂ 6.5 g，H₂S和NO₂ 2 g(常前发，2001)。这些有毒气体持续地释放，引起煤矿区居民呼吸道、癌症等疾病增加(陈贵荣等，2000)。煤矸石自燃所产生的H₂S，SO₂，CO和氮氧化物等有毒气体，严重危害着当地社区居民的身体健康。不断淋溶的有害物质，如重金属铅等，对煤矸山附近的地下水、地表农田系统，构成了潜在威胁(赵淑英等，2005；王金达等，2003)。因此，通过生物强化技术，在煤矸石山上构建人工生态系统，利用生物对土壤固定，对有害物质吸附和净化，达到减少甚至消除煤矸石山的不利环境影响，是切实可行性的改造煤矸石山的方法之一。然而，煤矸石风化物颗粒粗且养分含量少，大面积的覆土后，人工复垦种植不可能进行施肥，无法在自然状态下迅速形成符合植物生长的有机氮库(Bloomfield et al., 1982)。另外，煤矸石的强酸性以及大量的有毒物质，使普通的植物种，无法在自然条件下繁衍。因此，寻找能够在低营养高毒性环境种生存的植物种，成为煤矸石山生态恢复的关键问题。在这类研究中，菌根(mycorrhizae)作为土壤中菌根真菌与高等植物营养根系形成的一种互利联合体，因其对环境胁迫的高度适应性，受到关注(毕银丽等, 2002, 2005a; 2005b)。对内生菌根植物的研究显示，与非菌根植物相比，接种菌根真菌的植物可以吸收更多的营养，且抑制植株积累的过量有害元素。但是，对与木本植物结合的外生菌根真菌，在煤矸石生长环境中的反应，研究却非常少。本研究选择本实验室筛选的具有抗重金属污染能力的外生菌根真菌铆钉菇菌(Gomphidium viscidus)与白皮松(Pinus bungeana)作为研究对象，研究外生菌根真菌和接种植物的生长对煤矸石胁迫的反应，为在煤矸石山构建高生物多样性的生态系统提供理论基础。

1 材料与方法

研究所使用的外生菌根真菌铆钉菇菌由北京大学环境学院提供，白皮松种子由山西省种子公司提供。煤矸石山表层风化物采自山西阳泉三矿280煤矸石山，黄土取自280煤矸石山附近农田。将煤矸石风化物与黄土过1 mm土壤筛，按质量比配成混合基质(煤矸石风化物质量/总质量)，质量比为0%, 50%, 70%, 85%, 100%。以水土比2.5:1加入蒸馏水，配成土壤溶液，用力搅拌，静置24 h后抽滤，得到土壤提取液。其中以0%煤矸石基质提取液为对照，各组混合基质酸碱度及养分状况见表 1。

将上述0%，50%和100%的黄土煤矸石混合基质，在压力14万Pa，温度为126 ℃条件下灭菌20 min，后分别装入相应编号的花盆中待用，花盆容积约为1 dm³。用不同组分的煤矸石土壤提取液为溶剂，配备MMN培养基，加入1.5%琼脂后，在14万Pa压力下126 ℃高温灭菌20 min，倒入培养皿(Ø100 mm)中冷却凝固制备固体培养基。

2 试验处理和测定 2.1 外生菌根真菌试验

铆钉菇菌菌丝在无菌条件下，接种于不同土壤提取液制备的固体培养基的培养皿里。每个处理为5次重复。培养皿在25 ℃的培养箱中培养8 d，每天测量菌落直径。8 d后融化培养菌，将生长菌丝的固体培养基放入200 mL去离子水后在电炉上加热融解，定性滤纸过滤后以60 ℃去离子水冲洗菌丝；将菌丝体连同滤纸一起置于80 ℃烘箱中烘干24 h，然后置于干燥器内风干72 h，电子天平称量菌丝净质量。

2.2 接种白皮松试验

选择籽粒饱满的白皮松种子，流水清洗，然后用10%的H₂O₂浸泡5 min，灭菌消毒。用无菌水冲洗种子5次，清除种子表面的残存物，在60 ℃温水中浸种24 h，置于25 ℃恒温箱催芽，选取裂嘴露白的种子备用。将铆钉菇菌菌液接种于盆装的煤矸石混合土中，然后进行播种。生长8周后以显微镜检查接种率。

生长试验将裂嘴露白的种子播种于普通蛭石中，分别接种和不接种。接种采用土壤接种法进行接种，即将菌液直接接种于盆装的蛭石中，接种深度5 cm。无接种灭菌为对照。生长8周后，选取接种和不接种苗，分别移栽到上述3种不同的煤矸石土壤中。每类土壤接种和不接种苗木分别为3盆，独立培养，每盆10株。总幼苗处理数为3(土壤煤矸石比率)× 2(接种处理)×30(株数)。

生长期间，每周浇水和营养液各1次，保持土壤水分在20%左右。移栽2周后，测定移栽成活率。移栽8周后，随即抽取10棵幼苗，用直尺测定苗高，游标卡尺测定地径，计算侧根数、接种率(形成菌根的苗数/幼苗总数)、移栽成活率(移栽成活苗数/移栽总数)，将幼苗以105 ℃烘干10 h，恒定后测定植物干质量。

3 结果与分析 3.1 铆钉菇菌菌丝在不同土壤提取液中生长的状况

铆钉菇菌在不同比例的煤矸石土壤提取液中表现出良好的适应性(图 1)。在试验的前4 d，除了纯煤矸石提取液培养外，其他比例煤矸石提取液中的菌丝生长，与纯黄土提取液(对照)的生长相同。菌丝的生长在后期出现差异。菌丝生长1周后，85%煤矸石提取液中的菌丝直径为对照的76%，其菌丝生长显著受到煤矸石中有毒物质的抑制。但50%和75%煤矸石提取液中的菌丝生长状态良好，维持在对照的90%以上。该结果说明，铆钉菇菌在不同比例的混合土壤中，有广泛的适应性。

生长8 d后，测定菌丝干质量。根据测定的菌丝质量结果可以看出，煤矸石同样抑制了菌丝的生物量积累。菌丝在85%煤矸石混合土壤提取液中的积累生物量，仅是无煤矸石黄土提取液中的50%。当煤矸石混合量下降到50%时，生物量积累达到无煤矸石提取液的90%。按照邓肯多重极差测验可见，随煤矸石浸提液比例的增加，菌丝生长减弱，纯黄土溶液与50%煤矸石土壤溶液之间无差异，其他比例的煤矸石土壤溶液对菌丝生物量积累有显著抑制的影响。

3.2 混合煤矸石基质中白皮松幼苗外生菌根接种率和成活率

对种植在不同比例煤矸石混合基质上的接种幼苗，在显微镜下检查菌根发生比率。结果显示，铆钉菇菌菌根的接种率随煤矸石含量的增加呈下降趋势(表 2)。尤其在100%煤矸石环境下，感染率为0，菌根基本无法形成。这个结果与菌丝在煤矸石中无法发生和发展的结果相同。

8周的白皮松幼苗，移栽成活率极大地受到煤矸石的影响。未接种苗木，在黄土中的成活率为纯煤矸石的20多倍。但接种铆钉菇菌并形成菌根的白皮松幼苗，在3种不同比率的煤矸石基质中移栽成活率都远远高于未接种幼苗(表 2)。且随着随煤矸石混合比率的增加，菌根对成活率的促进作用也逐渐增加。在黄土和50%的煤矸石混合基质中，接种幼苗的移栽成活率分别比未接种幼苗成活率高12%和30%。尤其在纯煤矸石基质中，接种苗木成活率为接种苗木成活率的2倍。

3.3 接种白皮松在不同比例煤矸石基质中的生长

对生长在不同煤矸石含量基质中的接种和未接种白皮松的干质量、苗高、侧根数等进行测定，结果显示，白皮松幼苗的生长受到煤矸石的显著抑制，尤其是在100%煤矸石栽培基质上，无论是接种还是未接种白皮松幼苗，8周内基本没有生长。混合一定黄土，明显缓解了煤矸石的抑制作用(表 3)。在未接种情况下，纯煤矸石环境中白皮松的地径仅为黄土的67.1%，株高为其54.1%，侧根数为其54.2%，干质量为其49.8%。混合50%黄土后，地径增长为黄土的93.6%；株高增长为其的95.3%，侧根数增长为其的78.0%，干质量增长为其的84.8%。接种幼苗亦具有同样的趋势。

比较接种和未接种幼苗的生长指标可以看出，接种铆钉菇菌显著缓解了煤矸石对幼苗生长的影响。在50%煤矸石混合基质中，接种幼苗的所有4个测定指标都高于未接种幼苗。方差分析表明：接种幼苗的侧根数和幼苗干质量都显著大于未接种幼苗。菌根的这种生长促进作用在无煤矸石的基质中，尤其突出。但是，在纯煤矸石基质上，菌根幼苗并没有显示出比未接种幼苗更多的优势。

4 讨论

许多研究显示，煤矸石山植被恢复中，基质的低营养，尤其是低磷，是阻止植被生长的主要因子之一(毕银丽等，2005)。该研究对山西阳泉煤矸石提取液的营养成分分析显示(表 1)，与具有较高生产力的黄土相比较，煤矸石风化物的全氮、有效磷以及有机物含量，并不比黄土低，但pH值仅3左右。因此，改善土壤酸碱环境，可能是煤矸石山复垦的关键之一。根据本实验室前期研究，外生菌根真菌具有较广泛的酸碱适应范围，能在pH值3.5~7.5间存活(黄艺等，2006)。该研究中，菌丝能在煤矸石混合高达85%、pH值只有5.6的煤矸石提取液中生长和发展(图 1)，说明铆钉菇菌能克服煤矸石基质的强酸性。

在实际垦覆工作中，苗木移栽成活率一直垦覆工程成功的关键。虽然很少有研究探索外生菌根在煤矸石胁迫中的存活和生长，但许多研究菌根和环境胁迫的工作证实，外生菌根真菌能增加寄主植物对环境胁迫，比如过量重金属、干旱等的忍耐力(Huang et al., 2004；韩秀丽等，2006)，提高植物在这些胁迫环境下的存活能力。从研究结果看，接种外生菌根真菌，显著增加了生长在煤矸石基质的白皮松幼苗的成活率和生长能力(表 2、3)，这个结果初步证实，外生菌根真菌能增加寄主植物对煤矸石胁迫的忍耐力。从菌丝试验结果分析，外生菌根真菌对强酸环境的适应性，可能是形成这种忍耐力的主要原因之一。但是，煤矸石对生物生长的胁迫包括很多方面，如高含量的有毒元素、自燃产生的高温等。这些胁迫都将影响煤矸石山的复垦。因此，要建立以外生菌根植物为先锋植物和主要建群植物的人工生态系统，还需要对外生菌根植物在煤矸石胁迫下的生长和生理特性作进一步的研究。

该研究结果还显示，在纯煤矸石提取液中，菌丝无法生长和发展，在纯煤矸石基质上，幼苗无法与真菌结合。但只要混合少量黄土后，菌丝生长状况和苗木的成活以及生长，都能得到很大的改善(表 3)。这个结果揭示，苗木先接种，形成菌根后再种植在煤矸石上，对植物在煤矸石的定植非常重要。在煤矸石山的生态重新构建中，混上少量黄土，对保证生物修复的成功至关重要。当然，这些还需要进一步的田间试验来证实。