银杏(Ginkgo biloba)是原产于中国的孑遗植物，集食用、药用、绿化、观赏、药材于一体的多功能树种。但与其他高等植物相比，生长缓慢。银杏喜温暖气候(贺立红等，2006)，但是光合适温并不高(约20~26 ℃)(孟庆伟等，1995；郭志华等，1997)。银杏在生长季节中，不仅要度过高温强光的夏季，也会在春季特别是深秋遭遇冷凉强光的天气，还可能会在一天中历经上午和下午的冷凉强光与中午的高温强光。因此与强光相伴的炎热和冷凉对光合机构，特别是PSⅡ的光抑制影响有待进一步探讨。

光系统Ⅱ(PSⅡ)是位于类囊体膜上的高度组织的色素蛋白复合体，主要由反应中心复合体、捕光天线复合体和放氧复合体等亚单位组成，通过一系列光驱动电子传递最终使光能转化为化学能。光抑制是光化学量子产量下降的现象，主要与引起PSⅡ损伤的光破坏及防御光破坏的光保护有关(Long et al., 1994)。潘伟明等(2004)观察到夏季6—9月份受强烈光照和高温天气的影响，银杏的生长明显变慢。光合作用是植物干物质合成的基础。光合测试发现：银杏具有耐阴喜光忌强光的特性，超过光饱和点(约1 000 μmol·m^-2s^-1)的光强下，P_n明显下降(陶俊等，1999)；在晴天中午发生光合“午休”现象与强光、高温、空气干燥有关(杨模华等，2004)。张往祥等(2002)采用叶绿素荧光动力学测试技术证实银杏光合“午休”现象与光系统Ⅱ(PSⅡ)光抑制有关。并对银杏光抑制程度和叶黄素循环各组分含量的关系，特别是和玉米黄质(Z)的关系，以及D蛋白周转与光抑制的关系进行研究(孟庆伟等，1999；张宁等，1999)，同时提出夏季采用遮光、灌水(张往祥等，2002；景茂等，2005)或喷灌等措施减轻光抑制和光合午休程度，以期提高银杏的同化能力。目前高温强光对银杏的光合特性研究已有报道，但与强光相伴的炎热和冷凉对光合机构，特别是PSⅡ的光抑制影响及作用位点未见报道。

本研究以快速叶绿素荧光诱导动力学分析(JIP test)为手段，进行高低温处理下PSⅡ的光抑制研究，辨析冷热双向胁迫条件下银杏叶片PSⅡ中光抑制的作用位点及其保护机制，探寻能减轻光抑制和提高逆境光合能力的有效途径。

1 材料与方法 1.1 试验材料

2007年5月在河北省林木良繁场以‘园铃’银杏为试材。选取树冠南侧生长势一致的新梢中部叶片测定田间连体5次重复光合光强响应。

2007年9月于河北农业大学标本园银杏苗圃选取健壮‘园铃’银杏植株向阳处的枝条，剪下带有7片叶子的枝条，浸泡于盛有清水的烧杯中，将其带回实验室，进行光强照射处理和不同温度处理，5次重复。

1.2 试验方法 1.2.1 银杏叶片光强照射处理

选取银杏枝条上的第4~6片叶子，在光照培养箱中25 ℃下，用LED发光二极管白光光源分别在光强0，500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 μmol·m^-2s^-1下，照射处理20 min后室温下黑暗处恢复1 h进行叶绿素荧光动力学曲线及其参数测定。

1.2.2 银杏叶片温度处理

选取银杏枝条上的第4~6片叶子，置于光照培养箱中，分别在5、10、15、20、25、30、35、40和45 ℃的温度胁迫下，用光强PAR为1 000 μmol·m^-2s^-1的LED发光二极管白光光源照射处理20 min。处理后室温下黑暗处恢复1 h进行叶绿素荧光动力学曲线及其参数测定。

1.2.3 光合光强响应测定

采用英国PP Systems公司CIRAS-2型便携式光合系统，在CO₂浓度350 μL·L^-1、温度25 ℃下，进行光合光强响应测定。叶温、光强及CO₂浓度等均用该仪器自控系统控制。均为连体5次重复测定。测定部位为顶部第3~4片叶。光合光转化效率LCE是指净光合速率与入射光量的比值，即LCE=P_n/PAR_in。其中，LCE单位为molCO₂·mol^-1quanta，P_n单位为μmolCO₂·(m²·s)^-1，PAR_in单位为μmol·(m²·s)^-1。

1.2.4 叶绿素荧光参数测定

光强照射处理和不同温度处理后，采用英国Hansatech公司生产的植物效率仪(plant efficiency analyser，PEA，即连续激发式荧光仪或非调制式荧光仪)，根据Strasser等(2000)方法进行叶绿素荧光诱导曲线及其参数的测定。具体步骤如下：叶片暗适应10 min后，用1 950 μmol·m^-2s^-1饱和红闪光照射1 s下以10 μs(2 ms之前)和1 ms(2 ms之后)的间隔记录荧光信号，测得叶绿素荧光诱导曲线及其参数F_o、F_m。

叶绿素荧光参数的计算参考Strasser等(2000)的计算方法。暗适应下PSⅡ最大光化学效率F_v/F_m＝(F_m－F_o)/F_m。单位反应中心复合体吸收的能量ABS/RC＝M_o/V_J/(F_v/F_m)；单位反应中心以热能形式耗散的能量DI_o/RC＝ABS/RC－TR_o/RC；单位反应中心复合体中被核心捕获的能量TR_o/RC＝M_o/V_J。单位面积的光合机构含有的反应中心数目RC/CS_o＝(F_v/F_m)×(V_J/M_o)×F_o。复合体吸收能量中活性反应中心的数目RC/ABS＝[(1－(F_o/F_m))] / (M_o/V_J)。其中，荧光曲线的相对初始斜率M_o＝4×(F_{300 μs}－F_{50 μs})/(F_m－F_{50 μs})；2 ms时可变荧光V_J＝(F_{2 ms}－F_{50 μs})/(F_m－F_{50 μs})。

2 结果与分析 2.1 光合光转化效率LCE的光强响应

将测试的光合光强响应转化成光合光转化效率LCE的光强响应曲线发现，在光强约100 μmol·m^-2s^-1时银杏LCE最高，光强超过约1 000 μmol·m^-2s^-1时银杏LCE趋于最低(图 1)。

2.2 强光以及冷热胁迫对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的影响

在常温25 ℃下，不同光强照射20 min后银杏叶片的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线均呈现典型的O-J-I-P 4相型(图 2)。随着照射光强的增加(从500增至3 000 μmol·m^-2s^-1)，O-J-I-P 4相均呈逐渐下降趋势，但是，2 000 μmol·m^-2s^-1以上的照射光强会使O-J-I-P 4相大幅度下降。

随着冷胁迫温度的降低和热胁迫温度的升高，快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的J-I-P 3相呈现逐渐下降趋势(图 3)；而O相在冷胁迫下升高，在热胁迫下降低。其中，J-I-P 3相以常温25 ℃最高，30和35 ℃其次，低温15~5 ℃和高温40~45 ℃依次降至最低(图 3)。

2.3 强光以及冷热胁迫对PSⅡ最大光化学效率的影响

银杏叶片的PSⅡ最大光化学效率F_v/F_m，随着光强的增加呈现S型下降趋势(图 4)。与对照相比，2 000 μmol·m^-2s^-1的强光会使F_v/F_m值降低52.1%。

随冷胁迫温度的降低，银杏叶片的PSⅡ最大光化学效率F_v/F_m明显下降，10 ℃时的F_v/F_m值比常温25 ℃时的降低了23.4%，5 ℃时降低40%(图 5)。随着热胁迫温度的增加，同样导致F_v/F_m值明显下降(图 5)。但是，热胁迫比冷胁迫的F_v/F_m更为严重下降，因为5~20 ℃下F_v/F_m的直线回归斜率为k_cilling＝0.015 4，而25~45 ℃下为k_heat＝－0.018 2，|k_heat|比|k_chilling|增大了15.4%。

2.4 强光以及冷热胁迫对PSⅡ反应中心能流分配的影响

在Strasser等(2000)的能量流动模型参数中，当照射光强PAR超过1 000 μmol·m^-2s^-1时，银杏叶片单位反应中心复合体吸收的能量ABS/RC和单位反应中心以热能形式耗散的能量DI_o/RC会急剧增加(图 6)。

强光照射下PSⅡ反应中心能流分配状况受热胁迫影响较大(图 7)。与25 ℃相比，超过35 ℃的高温强光会引起ABS/RC和DI_o/RC的急剧增加，而5~10 ℃的低温胁迫对ABS/RC和DI_o/RC无明显影响。但是，TRo/RC受高温和低温胁迫的影响不明显。

2.5 强光以及冷热胁迫对PSⅡ反应中心数目的影响

当照射光强从0增加至1 500 μmol·m^-2s^-1时，银杏叶片单位面积的光合机构含有的反应中心数目RC/CS_o和PSⅡ复合体吸收的能量中活性反应中心的数目RC/ABS会明显下降；当光强超过1 500 μmol·m^-2s^-1时，RC/CS_o和RC/ABS降至最低(图 8)。

冷胁迫会降低PSⅡ反应中心数目，但是热胁迫会使之降低更多(图 9)。从图 9可见，与20 ℃相比，5~10 ℃下强光会使RC/CS_o和RC/ABS明显下降，而35~45 ℃下强光会使之更严重下降。

从图 5和图 9可得知，冷热胁迫下强光引起的光抑制(F_v/F_m)与PSⅡ反应中心数目RC/CS_o或RC/ABS与之间显著正相关(相关系数分别为0.972或0.807)。

3 讨论 3.1 银杏光抑制作用效果

当植物光合机构吸收的光能超过光合作用所能利用的数量时，引起光合效率降低现象称为光抑制。研究者认为：光抑制不仅发生在强光下，有环境胁迫存在时中度光强就可引发光抑制(Robert et al., 1986)。离体试验证明：只要照光时间足够长，PSⅡ反应中心在弱光下依然会发生光抑制(Park et al., 1995)。而且当光抑制达到一定程度，就会发生植物光合器官的破坏即光破坏(主要是D1蛋白的净损失)。

用1 200 μmol·m^-2s^-1强光照射胁迫5 h，银杏叶片发生严重的光抑制(李新国等2004)；夏季田间光照超过饱和光强(午间高达1 400~1 500 μmol·m^-2s^-1)，导致银杏严重光抑制的发生(张往祥等，2002；孟庆伟等，1999)。高温强光(42 ℃，1 000 μmol·m^-2s^-1光照处理2 h，对照25 ℃)导致黄瓜(Cucumis)叶片的光合作用发生光抑制现象(孙艳等，2006)。低温增加冷敏感植物和抗冷植物发生光抑制的可能性(Hetherington et al., 1989)。Sonoike(1996)提出冷敏感植物低温光抑制的条件：(1)低温(0~10 ℃)；(2)氧；(3)弱光(约100 μmol·m^-2s^-1)；(4)相对长时间的低温处理(约5 h)；(5)冷敏感植物(如黄瓜等)；(6)从PS(光系统)发出的电子流正常。

本研究对光合光转化效率LCE的光强响应测试分析表明：在达到最大LCE之前的光强(100 μmol·m^-2s^-1)下，为光合机构快速启动过程；在光强100~1 000 μmol·m^-2s^-1范围内银杏LCE逐渐降低，为光合机构趋于满负荷运转过程；在光强超过约1 000 μmol·m^-2s^-1时银杏LCE趋于最低，进入较为严重的光抑制过程(图 1)。通过快速叶绿素荧光诱导动力学曲线及其参数F_v/F_m分析可见，在25 ℃常温下光强超过1 000 μmol·m^-2s^-1(照射20 min)时银杏光抑制程度明显加重(图 2和图 4)。因此，银杏光抑制呈现光强剂量效应。还发现银杏光抑制的温度剂量效应，15 ℃以下低温和35 ℃以上高温均会使F_v/F_m进一步降低(图 3和图 5)；而且热胁迫比冷胁迫的光抑制程度更大，因为25~45 ℃下F_v/F_m的|k_heat|比5~20 ℃下的|k_cilling|增加15.4%。

3.2 冷热胁迫下银杏光抑制作用位点与保护机制的转移动态

一般认为，光抑制主要发生在光系统Ⅱ(PSⅡ)(Krause et al., 1991)。光抑制可能是光合机构被光破坏(Powles, 1984)和能量耗散过程加强运转(Demmig et al., 1992)的共同结果，也可能仅仅是能量耗散过程加强运转的反映(汪炳良等，2004)。许大全(2002)指出：在没有其他严重环境胁迫的自然条件下，光抑制主要热耗散过剩光能从而保护光合机构免遭光破坏的过程；而光破坏的发生常常是强光与其他严重环境胁迫(如低温、干旱、营养亏缺等)共同作用的结果(郭连旺等，1996)。

热胁迫会导致PSⅡ结构和功能的一系列变化甚至损害(宋春雨等，2002)。热胁迫会引起类囊体膜的流动性增加导致PSⅡ蛋白复合体的稳定性降低、造成外周天线LHCⅡ与PSⅡ中心分离(Goltsev et al., 1987)、诱导PSⅡ活性中心转化为无活性中心(Cao J et al., 1990；温晓刚等，1996)、致使一些光合碳循环及活性氧清除酶系统被钝化、PSⅡ的供体侧(OEC)比受体侧更易受到伤害而发生放氧复合体失活(Guissé et al., 1995；Srivastava et al., 1997)、以及热耗散DI_o/RC有大幅度的增加(王梅等，2007)。

高温强光处理比单独高温或单独强光的光抑制程度更为严重。非辐射能量(非光化学猝灭系数NPQ)消耗增加对防御光破坏起着重要的作用(徐凯等，2005)。高温或强光下出现过剩光能使叶黄素循环启动，但高温使强光下叶黄素循环明显受到抑制。

随着对光抑制和光保护机制研究的不断深入，低温光抑制的生化保护机制的研究主要集中在PSI和PSⅡ中叶黄素循环的保护作用(Demmig et al., 1992)、D1蛋白周转的保护作用(曾纪晴等，1997)、PSⅡ光抑制对PSI的保护作用(李新国等，2002)等方面。

低温导致黄瓜叶片严重的光抑制，同时类囊体膜不饱和脂肪酸含量下降(代玉华等，2004)。孙艳等(2006)观察到非辐射能量消耗增加(非光化学猝灭系数NPQ的升高)和叶黄素循环启动对黄瓜叶片防御高温强光(42 ℃，1 000 μmol·m^-2s^-1处理2 h，对照25 ℃)导致光破坏起着重要的作用。夏季晴天田间高温强光下，银杏叶片天线热耗散和叶黄素循环引起的非辐射能量耗散增加、D1蛋白的可逆失活与快速周转或PSⅡ反应中心可逆失活是避免强光损伤的保护性反应。

本研究中，与冷胁迫光抑制相比，热胁迫光抑制下会显著加强银杏叶片PSⅡ能量耗散运转过程，这与热胁迫下PSⅡ反应中心数目降低更多有关。通过Strasse的能量流动模型参数分析可见，5~10 ℃的低温强光引起银杏叶片热耗散DI_o/RC略微增加，而35 ℃以上的高温强光会热耗散DI_o/RC剧增(图 8)。同时可见冷胁迫会降低PSⅡ反应中心数目，但是热胁迫会使之降低更多(图 7)。据此推测，热胁迫下在PSⅡ蛋白复合体的电子传递过程中，由于PSⅡ反应中心可逆失活(即PSⅡ的异质性)(温晓刚等，1996)会阻止被天线色素吸收的能量向下游传递，被PSⅡ反应中心捕获的电子流TR_o/RC变化不明显(图 7)，致使剧增的单位“有活性反应中心”复合体吸收的能量ABS/RC(图 7)必须以热能形式耗散掉。因此，热胁迫下造成PSⅡ“有活性反应中心”减少，进而导致能量耗散过程运转加强，表现出热胁迫光抑制加重；同时，PSⅡ的这种异质性(PSⅡ反应中心的可逆失活)亦是热胁迫下光合机构发生光抑制的保护机制。

尽管冷胁迫光抑制不如热胁迫光抑制严重(图 5)，而且冷胁迫下PSⅡ反应中心数目降低不如热胁迫的严重，可是冷胁迫下F_v/F_m的降低趋势与PSⅡ反应中心数目的降低趋势相近(图 5和图 9)。PSⅡ的这种异质性(PSⅡ反应中心的可逆失活)亦是冷胁迫下光合机构发生光抑制的保护机制。但是冷胁迫下热耗散DI_o/RC的增加趋势不明显。过剩光能耗散可能与活性氧清除系统运转加强有关，也可能与低温环境下有助于叶片的热传导和热幅射散热有关。该方面有待深入研究。

无论是热胁迫还是冷胁迫，银杏快速荧光诱导动力学曲线仍然呈现OJIP型，均未出现与放氧复合体失活有关的K相。因此推测高温强光未对银杏的PSⅡ供体侧(OEC)产生明显影响；也推测涉及到低温强光下可能活性氧清除系统对PSI保护发挥着一定的作用，该方面尚需深入研究。