随着石油资源短缺形势日趋严峻，燃料乙醇作为可再生的替代能源越来越受到重视，为消化大量陈化粮，我国于2001年批准了4个用陈化粮生产燃料乙醇的试点企业。但是，目前粮食燃料乙醇已经开始叫停，2007年5月，财政部制定施行的《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》中亦未把玉米、小麦、水稻等粮食列为生产燃料乙醇的原料。在这种大背景下，众多国家和企业正努力探索生产燃料乙醇的新原料，其中纤维质乙醇因其原料来源丰富、原料成本低廉、适合可持续发展要求而成为研究热点。

我国竹子资源非常丰富，素有“竹子王国”的美誉，丰富的竹类资源为竹子深加工及产业化开发提供了良好的条件。我国是毛竹的原产地(Andy et al., 2001)，全国现有竹林面积约500万hm²，毛竹林有300万hm²，年产量近1亿t(蒋应梯，2002)。目前竹材加工企业较多，如竹胶合板、竹纤维板等产品的生产企业，每年的产值达几十亿元。在竹材加工的过程中产生了大量废弃物，例如，对于年产3万m³竹胶板的企业，生产过程中产生的竹枝、竹节等下脚料即达9 000 m³(蒋应梯，2002)。若能将这些下脚料加以开发利用，其经济效益和社会效益都将非常显著。而当前国内对纤维质乙醇新原料的探索主要是农业废弃物，如玉米秸秆(Tae et al., 2003)、稻草(朱圣东等，2005)、小麦秸秆(Jan et al., 2007)等，对于竹废弃物的研究却还没有引起重视。Chikako等(2005)开展了采用蒸汽爆破竹材加工下脚料的研究，再通过一系列转化方法可以获得乳酸、抗菌色素、甲烷、单糖、寡糖、环氧树脂、活性炭等有价值物质，但是利用生物预处理竹废弃物有用物质的研究还未见报道。

纤维质乙醇的生产过程一般涉及到原料预处理、纤维素酶水解、乙醇发酵等几个基本环节(Sun et al., 2002)。纤维质原料中的骨架木质纤维素结构复杂，纤维素因镶嵌在由木质素和半纤维素交联形成的网状结构中而难以被纤维素酶水解，预处理是纤维质原料改性及提高纤维素酶水解效率的关键技术。理化预处理是当前研究得比较成熟的预处理方法，生物预处理能耗较低，对环境危害小，是很有前景的预处理技术(Sun et al., 2002)。本研究利用2株对竹粉中的木质素具有将强降解能力的白腐菌Coriolus versicolor B1和Ganoderma lucidum En处理毛竹粉，探讨了白腐菌预处理毛竹粉对纤维素酶糖化的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

菌株：彩绒革盖菌(Coriolus versicolor) B1和灵芝菌(Ganoderma lucidum) En，其中Coriolus versicolor B1采自湖北神农架自然保护区，Ganoderma lucidum En采自武汉喻家山。经前期对20余株白腐菌的筛选发现，这2株菌对竹粉中的木质素具有相对较强的降解能力。

竹子：毛竹(Phyllostachys pubescens)，采自于湖北咸宁，2~3年生，为中、小型散生竹。伐其直径约1~2 cm的枝条部分，风干，去叶后粉碎、烘干，过40目，备用。

纤维素酶：由河南天冠集团提供，其FPU酶活为100 IU·g^-1。

1.2 白腐菌预处理竹粉

将活化好的B1及En斜面菌种划成小块，挑入PDY液体培养基(Wang et al., 2004)中于150 r·min^-1 25 ℃培养7 d获取液体菌种。在250 mL三角瓶中按照竹粉:自来水＝1:1.5的质量体积比配制竹粉培养基，于121 ℃下蒸汽灭菌30 min后取出放置冷却至室温。分别将B1及En的PDY液体菌种按照10%的接种量接入竹粉培养基中进行生物预处理，预处理温度为25 ℃。

将白腐菌预处理一定时间的竹粉样品取出于105 ℃烘干，粉碎后备用。以未经白腐菌处理的竹粉原料作为空白对照。

1.3 竹粉样品的酶解糖化

称取白腐菌预处理后的竹粉样品置于塑料离心管中，以1:50的固液比加入纤维素酶酶液及pH为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，纤维素酶用量为20 IU·g^-1，50 ℃下200 r·min^-1酶解48 h后以定性滤纸过滤，获得滤液并用DNS法(Cai et al., 1999)测还原含量。其糖化率按下式计算：糖化率(%)＝(反应体系中还原糖的质量/反应体系中纤维素与半纤维素的总质量)×100%。

1.4 竹粉中木质纤维素含量测定

以差重法(杜甫佑等，2004)测试预处理前后竹粉中的纤维素、半纤维素和酸不溶木质素的相对含量，该相对含量分别表示纤维素、半纤维素和酸不溶木质素所占竹粉样品中的质量百分数。白腐菌对竹粉中主要成分的降解率按以下公式计算：纤维素(半纤维素或木质素)降解率(%)＝[预处理前纤维素(半纤维素或木质素)总质量－预处理后纤维素(半纤维素或木质素)总质量]/预处理前纤维素(半纤维素或木质素)总质量×100%，其中，纤维素(半纤维素或木质素)总质量＝纤维素(半纤维素或木质素)相对含量×竹粉总质量。每个样品做3个平行样，用统计学方法求平均值及方差。

2 结果与分析 2.1 白腐菌预处理后竹粉的质量损失

白腐菌是一类功能学上的真菌，因其能引起木材白腐而得名。白腐菌在腐朽木材等木质纤维类原料时，不但可以破坏木质纤维素复杂得网络结构，降解木质素并使其矿化为CO₂和H₂O(Flournoy et al., 1993)，而且需要利用原料中的可溶性成分，如淀粉、可溶性糖、半纤维素、纤维素等易于降解或吸收物质来作为维持其生长的能量来源(Kirk et al., 1987)。因此，白腐菌预处理会导致原料质量损失。图 1所示的2条曲线分别显示了C. versicolor B1和G. lucidum En预处理引起的竹粉质量损失率随预处理时间的变化曲线。从图 1可以看出，白腐菌C. versicolor B1和G. lucidum En预处理对竹粉质量损失率的影响存在相同点和不同点。相同点表现在2株菌均在预处理前期的质量损失速率大后期质量损失速率小，在前40 d的质量损失率都几乎呈现直线上升，之后变缓。这种共同的变化规律提示，白腐菌对木材的高效腐朽在预处理早期，这可能与白腐菌相关降解酶的分泌时期直接相关(林云琴等，2003)，后期由于白腐菌的衰老和死亡，酶的分泌活动减弱。质量损失规律的不同之处在于G. lucidum En前期的质量损失速率显著大于C. versicolor B1。白腐菌C. versicolor B1前期引起的竹粉质量损失较大，预处理10 d时的损失率即达12.5%；而G. lucidum En前期引起的质量损失较小，到20 d后质量损失迅速增加，预处理50 d时竹粉质量损失高达46.0%。2株白腐菌引起的质量损失变化规律不同可能是因为它们对竹粉中木质纤维素主要成分降解的启动时间差异造成的。

2.2 白腐菌B1和En预处理对竹粉糖化的影响

经白腐菌C. versicolor B1和G. lucidum En预处理后的竹粉样品用纤维素酶进行酶解，图 2展示了白腐菌处理竹粉不同时间的糖化率变化曲线，其中预处理0 d的样品表示的是未经白腐菌预处理的竹粉样品。所有糖化率的结果已经把白腐菌预处理引起的酶解底物损失计算在内。

从图 2可以看出，随着白腐菌处理时间延长，白腐菌C. versicolor B1和G. lucidum En引起的竹粉糖化率的变化趋势不同。竹粉不经过预处理直接糖化后糖化率为10.7%，经G. lucidum En预处理后竹粉的糖化率先升高再降低，20 d时糖化率最高，达到13.5%，比对照提高了26.9%。经C. versicolor B1预处理后竹粉的糖化率呈现先降低再升高再降低的变化趋势，预处理30 d时糖化率最高，可达12.9%，比对照提高了19.2%；而在C. versicolor B1预处理的前期，竹粉的糖化率却是低于对照的。因此，白腐菌G. lucidum En预处理对糖化率的提高程度优于C. versicolor B1。白腐菌G. lucidum En的最佳预处理时间为20 d，C. versicolor B1的最佳预处理时间为30 d。

2.3 白腐菌B1和En预处理改性竹粉

白腐菌在生长的同时可以降解竹粉中的纤维素、半纤维素及木质素3种主要成分，从而使竹粉改性。图 3A~C分别展示了白腐菌预处理前后纤维素、木质素及半纤维素的相对含量变化，其中0 d的样品代表未经白腐菌处理的竹粉原料。从图中可以看出，竹子原料中纤维素的含量较高，比硬木稍低比小麦秸秆高，木质素的含量与硬木相当(Sun et al., 2002)，纤维素、半纤维素及木质素三者的含量依次为35.7%、26.5%和18.7%，说明竹子作为燃料乙醇生产原料具有较大的潜能。白腐菌C. versicolor B1预处理后竹粉中的纤维素、半纤维素及木质素含量均高于白腐菌G. lucidum En预处理后的样品。木质纤维素体系中木质素含量是影响纤维素酶高效接触和有效吸附的关键因素(Sun et al., 2002)。木质纤维素网状结构中纤维素被木质素和半纤维素包裹，从而导致纤维素酶不能接近纤维素；同时木质素可以吸附纤维素酶而不能使其解吸附，形成木质素对纤维素酶的非有效吸附，使反应体系中的游离酶大量减小。白腐菌G. lucidum En在预处理竹粉的前期就引起样品中木质素含量的急剧降低，有效改性竹粉，从而达到提高其酶解效率的结果。

2.4 白腐菌B1和En对竹粉中木质纤维素的降解

图 4A~C分别显示了白腐菌对竹粉中半纤维素、纤维素及木质素的降解状况。从图中可以发现，白腐菌G. lucidum En对竹粉中3种主要成分纤维素、半纤维素及木质素的降解率和降解速率均显著高于C. versicolor B1。对比不同预处理时间段白腐菌对竹粉中3种主要成分的降解率可以发现，2种菌株存在相同的规律，即半纤维素降解率>木质素降解率>纤维素降解率。杜甫佑等(2005)研究发现，白腐菌对木屑基质中纤维素、半纤维素和木质素三者的降解具有一定的顺序和选择性，即先降解半纤维素和木质素，再同时降解半纤维素、纤维素和木质素，从图 4A~C的结果可以推测，白腐菌G. lucidum En和C. versicolor B1在竹粉上具有相同的降解规律，半纤维素的降解先启动，纤维素和木质素的降解在其之后。白腐菌对不同组分降解的启动顺序影响到不同预处理时段竹粉中能源底物的流失量，从而影响到竹粉的糖化率。因此，减缓纤维素降解的启动降低能源底物流失及加速木质素降解的启动改性竹粉是影响生物预处理效率的关键因素。

3 讨论 3.1 生物质酶解的关键因素及白腐菌预处理对竹粉的改性作用

生物质原料的性质直接影响纤维素酶对其酶解的效率和程度，高纤维素含量低木质素含量和生物质的可及面积及多孔性的增加对下一步的酶解工艺是非常有利的。一方面，木质素通过非专一性的疏水作用竞争性地与纤维素酶CBD (cellulose binding domain)结构域结合(Karin et al., 2007)，从而影响纤维素与纤维素酶CBD的结合；另一方面随着纤维素的水解，纤维素酶CBD被释放可以重新吸附新的纤维素，而结合了木质素的纤维素酶CBD却不能被释放，从而导致木质素对纤维素酶的非有效吸附及纤维素酶的失活。

白腐菌预处理可以有效改性竹粉，预处理一定程度的竹粉纤维素显著提高，木质素含量有所降低；糖化率明显提高，白腐菌G. lucidum En的预处理效果优于C. versicolor B1。但是，糖化率同时受到纤维素总量的影响，当纤维素被降解得较多时，虽然改性的竹粉对纤维酶的反应性提高，但是总糖化率并未提高。因此，采用白腐菌预处理竹粉提高糖化率的过程中，在快速高效去除木质素减小其对纤维素酶的阻碍作用的同时，还要考虑白腐菌对纤维素的降解，采取有效措施减少生物处理造成的纤维素与半纤维素流失。

3.2 高效预处理菌种的筛选及预处理条件的优化

白腐菌预处理虽然能够显著提高竹粉糖化率，但是预处理的效果和最佳时间因菌种而异，白腐菌G. lucidum En需要20 d达到最优的预处理效果，C. versicolor B1则需要30 d。白腐菌预处理虽然效果显著，节能环保，但是预处理时间过长无疑会增加成本，因此进一步开展筛选高效菌株提高糖化率并缩短生物预处理时间，以及优化生物预处理条件以改良预处理效果的研究势在必行。

在菌种选育方面，要广泛从野生环境中采集、筛选获得更高效的选择性降解木质素和有效破坏木质素纤维素网络结构的白腐菌菌株，同时结合生物制浆的研究基础通过分子生物学手段选育纤维素酶缺失突变株。另一方面，通过优化生物预处理条件，调控白腐菌菌株的漆酶、锰过氧化酶、木质素过氧化物酶及纤维素酶、半纤维素酶的分泌规律，以缩短白腐菌预处理的时间和提高预处理效果。

3.3 竹子作为纤维质乙醇原料的可行性探讨

我国竹子资源丰富，且竹子中纤维素的含量较高，约为35.7%，半纤维素含量达到26.5%，适合作为纤维质乙醇生产原料进行研究。竹材加工过程中的竹废弃物数量庞大，目前对这些废弃物的利用非常有限，一般是抛弃或者焚烧，不但造成资源浪费，而且污染环境，因此，把大量的竹废弃物用于纤维质乙醇的生产很值得进行深入研究。但是，竹子相比于稻草、玉米秸秆等一年生草本植物而言，竹子结构牢固难以被破坏和降解，因此糖化率较低，最高只有13.5%。竹子作为纤维质乙醇原料的研究中，把白腐菌预处理与其他预处理方式相结合或者寻找适合竹子结构的预处理方式是提高竹子糖化率的关键。