白桦(Betula platyphylla)为桦木科(Betulaceae)桦木属植物，在我国分布范围广，适应性强，资源丰富(杨传平等，2004)。白桦树皮提取物成分复杂，药理作用多样。目前研究证实白桦中富含白桦酯醇、白桦酯酸等三萜类物质。白桦酯酸及其衍生物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降酯、利胆和保肝等作用，促进巨噬细胞和脾细胞分泌TNF，增加巨噬细胞的细胞毒活性，提高机体的非特异性免疫功能(李薇等，2000；Baltina，2003；Li et al., 2000)。另有报道，白桦酯酸阻止HIV与细胞的结合过程而使其难以进入细胞，并且抑制了DNA聚合酶的活性(Taisei et al., 2001；Soler et al., 1996)。因此，作为一种新型的天然药物，白桦三萜类物质具有广泛的开发利用前景。

当前国内外对白桦三萜类物质的提取及分离基本以天然资源为主，但由于天然资源十分有限，满足不了长期用药的需求。因此，研究利用白桦细胞培养技术生产三萜类物质将对大规模商业化生产白桦重要活性成分奠定基础。但白桦组织培养中次生代谢物的研究至今未见报道。本文通过研究培养基种类、不同植物生长调节剂组合对白桦愈伤组织生长及其三萜类物质积累的影响，优化其培养条件，从而为规模化生产白桦有效药用成分提供一定的理论依据及技术支持。

1 材料与方法 1.1 材料

白桦母树选自东北林业大学白桦强化种子园5~7年生嫁接优树(接穗30年生)，试验用外植体取自由优树腋芽诱导的组培苗。

1.2 方法

1) 愈伤组织的诱导  选择生长状态良好的白桦组培苗，在超净工作台上取其茎段切成1 cm左右，去掉茎段表面的叶片及芽点，接种于适于白桦愈伤组织生长的IS培养基上进行诱导(詹亚光等，2002)，添加植物生长调节剂配比为：1) 6-BA(0.8 mg·L^-1)和NAA(0.2，0.4，0.6 mg·L^-1)；2)KT(0.5 mg·L^-1)和2，4-D(0.5，1.0，1.5 mg·L^-1)；3)6-BA(0.2，0.4 mg·L^-1)和TDZ(0.1，0.2 mg·L^-1)。每瓶3个外植体，每个试验均重复3次，每个重复20~30个外植体。

2) 适于愈伤组织生长和三萜积累的基本培养基与植物生长调节剂配比的筛选  将诱导出的白桦愈伤组织(诱导培养基为IS+0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1 NAA)在第2次继代时，进行不同培养基和植物生长调节剂配比处理。不同培养基的处理条件为：培养基为MS、NT、IS、WPM、B₅，植物生长调节剂为0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1 NAA。不同植物生长调节剂配比处理的基本培养基为IS，植物生长调节剂配比分为2个组合：组合1为6-BA和NAA，浓度为1)0.2 mg·L^-1 6-BA+0.4 mg·L^-1NAA；2)0.8 mg·L^-16-BA+0.6 mg·L^-1NAA；3)1.0 mg·L^-1 6-BA+1.2 mg·L^-1 NAA。组合2为6-BA和TDZ，浓度为1)0.2 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 TDZ；2)0.4 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 TDZ；3)0.4 mg·L^-16-BA+0.15 mg·L^-1 TDZ。愈伤组织培养每5 d收获1次，称其鲜质量并检测三萜含量。每个试验均重复3次，每个重复10~20个外植体。试验所用培养基中均添加20 g·L^-1蔗糖和5.3 g·L^-1琼脂粉，pH值为6.0~6.5。每25 d继代1次。每瓶3个外植体。培养基均以121 ℃高压灭菌20 min，培养温度为25~27 ℃，光照强度为2 000 lx，光照16 h·d^-1，湿度为40%~50%。

3) 细胞活力测定(TTC法)  将培养的愈伤组织每5 d取样1次。称取愈伤组织0.20 g (鲜质量)用TTC法测定其细胞活力(刘华等，2001)。

4) 三萜样品的制备及检测  取新鲜的愈伤组织于80 ℃下烘干至恒质量后研磨，精确称取0.1 g样品放入50 mL离心管中加入95%乙醇10 mL浸泡过夜(3次)，合并提取液后加入0.5 g活性碳于40 ℃下超声(超声频率为10 kHz)40 min，以10 000 r·min^-1离心10 min取上清液过滤纸浓缩蒸干，以2 mL乙酸乙酯复溶后即得到样品。三萜类物质含量以紫外分光光度法测定(孙宏等，2005)。精密移取待检测样品100~200 μL，置于试管中于70 ℃水浴中蒸干。加入200 μL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入800 μL高氯酸后摇匀，置于70 ℃的恒温水浴中15 min，流水冷却至室温，加乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀，同时以试剂为空白对照，用1 cm比色皿测定551 nm处的吸光值。

2 结果与分析 2.1 不同植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织诱导的影响

植物生长调节剂配比为1) 6-BA和NAA、2) KT和2，4-D、3) 6-BA和TDZ的3种组合均能诱导白桦组培苗茎段产生愈伤组织，但愈伤组织形态及生长状态存在很大差异(表 1)。其中，6-BA和NAA组合对白桦愈伤组织的诱导效果最好，经多次继代后愈伤组织仍能保持良好的生长状态。当NAA浓度较低时，诱导的白桦愈伤组织较小，且脱分化不完全，表面有丛生芽；适当的6-BA与NAA组合对白桦愈伤组织的诱导效率最高，诱导率为100%，愈伤组织生长快，而且能获得适于继代培养的黄绿色的愈伤组织。6-BA和TDZ组合对白桦愈伤组织的诱导效果较差，最高的诱导率也只有84.52%，而且此种植物生长调节剂组合诱导出的愈伤组织易老化变黄，继代时间一般不能超过25 d，且经多次继代后愈伤组织生长状态有所下降。2，4-D和KT组合对白桦愈伤组织诱导效果一般，愈伤组织极易老化死亡，经多次继代愈伤组织生长已经很慢，且质地逐渐致密。

综上所述，由于NAA和6-BA组合对白桦愈伤组织的诱导效果最好，所以在其后白桦愈伤组织诱导的植物生长调节剂组合均为NAA和6-BA。而2，4-D和KT组合由于愈伤组织生长很慢不适于白桦细胞培养生产三萜，所以在其后不同植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织生长及三萜含量积累的试验中没有用到此植物生长调节剂组合。

2.2 不同培养基类型对白桦愈伤组织生长及三萜积累的影响

白桦愈伤组织在MS、NT、IS、WPM和B₅ 5种不同培养基中培养时，愈伤组织的鲜质量均呈增长趋势，随着培养的进行，白桦愈伤组织鲜质量增长趋于平缓(图 1)。在不同培养基上培养的愈伤组织在形态上没有明显的差异。不同培养基种类对白桦愈伤组织鲜质量积累有显著影响，其中鲜质量增长最快的为WPM培养基，而NT培养基鲜质量增长最慢。

在5种培养基中，白桦愈伤组织的细胞活力几乎都在15 d左右出现最大值，只有NT培养基出现在20 d左右(图 1)。说明培养15 d左右是白桦愈伤组织生长的最旺盛期，而且培养基中营养物质也相对充足，细胞活力呈现最高值，而随着培养的进行，培养基中的营养物质逐渐消耗，愈伤组织细胞开始老化，因而细胞活力逐渐降低。

白桦愈伤组织中的三萜在5种培养基中均表现为15 d左右含量最高(图 1)。用IS培养的愈伤组织其三萜含量最高，达到2.367 0 mg·g^-1DW，而用WPM培养的愈伤组织三萜含量最低，说明白桦愈伤组织生长与其三萜积累是不同步的。在5种培养基中只有WPM培养基中的NH₄⁺:NO₃^-为1:1，而其他几种培养基的NO₃^-均高于NH₄⁺。NH₄⁺中长时间培养会导致细胞中毒，引起细胞老化。IS培养基中的NO₃^-略高于NH₄⁺，而且IS培养基中的有机物含量最为丰富，说明培养基中略高的NO₃^-/NH₄⁺以及相对丰富的有机物有利于白桦愈伤组织产生三萜。

2.3 不同植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织生长及三萜积累的影响

在添加的植物生长调节剂组合为6-BA与NAA或6-BA与TDZ的培养条件下，白桦愈伤组织的鲜质量均呈增长趋势，但积累量存在一定的差异。6-BA和TDZ组合形成的愈伤组织呈绿色，生长快，质地较松散；6-BA和NAA组合培养的愈伤组织呈黄绿色，生长较快，质地较致密。6-BA和TDZ组合培养的愈伤组织鲜质量增长明显高于6-BA和NAA组合培养的愈伤组织(图 2)，说明TDZ对白桦愈伤组织生长的影响大于NAA的作用。在6-BA和TDZ组合中，0.4 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 TDZ组合对愈伤组织鲜质量的增长最有利，收获时每瓶鲜质量为14.08 g；当TDZ浓度较高或6-BA浓度较低时对愈伤组织生长都不利。在6-BA和NAA组合中，1.0 mg·L^-1 6-BA+1.2 mg·L^-1 NAA组合对于愈伤组织生长有利，收获时每瓶鲜质量为9.21 g，说明高浓度的6-BA和NAA配比对白桦愈伤组织生长有利。

6-BA与NAA组合和6-BA与TDZ组合都使白桦愈伤组织细胞活力的最大值出现在15 d左右，说明15 d左右是白桦愈伤组织生长的最旺盛期(图 2)。另外，不同植物生长调节剂组合及浓度对愈伤组织的细胞活力的影响有所不同。其中，6-BA和TDZ组合形成的愈伤组织细胞活力值高于6-BA和NAA的组合，而在同一植物生长调节剂组合中，中等浓度水平的植物生长调节剂组合细胞活力值最高。

6-BA与NAA组合或6-BA与TDZ组合培养的白桦愈伤组织中，三萜的积累量不同，但均在15 d左右达到高峰(图 2)。在所有组合中0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1 NAA培养的愈伤组织中三萜含量最高，达到3.531 9 mg·g^-1。植物生长调节剂对白桦愈伤组织生长及其三萜积累的影响是不同的，表现为6-BA和TDZ的组合更有利于白桦愈伤组织的生长，但没有提高三萜的积累；而6-BA和NAA的组合却有利于三萜的积累。在6-BA和TDZ的组合中，低浓度的6-BA和TDZ有利于三萜的积累，0.2 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 TDZ组合中三萜含量达到3.007 6 mg·g^-1。6-BA和NAA的组合中，6-BA和NAA组合的浓度较低或较高均不适于白桦三萜的积累。

3 结论与讨论 3.1 不同植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织诱导的影响

外源植物生长调节剂的种类和浓度均影响白桦愈伤组织的诱导，NAA与6-BA结合能更有效地诱导白桦愈伤组织的产生，且愈伤组织生长旺盛，不易老化，能进行多次继代。因此，对白桦诱导愈伤组织来说用NAA更适宜。2，4-D能诱导出白桦愈伤组织，但愈伤组织生长较慢，且不适于愈伤组织长期继代。这与詹亚光等(2002)的研究结果一致。TDZ对白桦愈伤组织的诱导率较低，且诱导出的愈伤组织不能适应长期继代，因此不太适于白桦愈伤组织的诱导。

3.2 不同培养基对白桦愈伤组织生长及三萜积累的影响

不同培养基的组成差异很大，对植物细胞的生长及次生代谢物的产生也有很大的影响，表现为不同的培养基适合生产不同的次生代谢物(甘烦远等，1991)。MS培养基对红花(Carthamus tinctorius)愈伤组织生长和α-生育酚的形成最有效(王镨等，1999)。MS培养基对水母雪莲(Saussurea medusa)愈伤组织生长和黄酮类形成最有效(李茂寅等，2000)；LS培养基对鸡冠花(Celosia cristata)愈伤组织生长及花青素积累的效果最佳(王惠珍等，2004)；B₅培养基有利于杜仲(Eucommia ulmoides)愈伤组织生长及总黄酮的形成(李琰等，2004)。本试验用5种不同的培养基对白桦愈伤组织进行培养，结果显示IS培养基对白桦愈伤组织的生长和三萜类物质的积累最为有利，原因在于IS培养基是5种培养基中有机物质含量较高且种类较全面的一种，而且白桦愈伤组织不易老化，说明IS培养基能充分提供白桦愈伤组织生长以及白桦三萜合成所需的养分。

培养基中的NO₃^-和NH₄⁺之间的比例对植物细胞的生长及次生代谢物的产生的影响也较为明显，培养基中NO₃^-浓度高有利于云南红豆杉(Taxus yunnanensis)愈伤组织的生长，NH₄⁺浓度高有利于提高愈伤组织的紫杉醇含量(陈永勤等，2000)；郑穗平等(1998)的试验结果表明玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)愈伤组织生长和花色素的积累要在低的氮源水平上，NH₄⁺对细胞的生长有明显的抑制作用，高浓度NH₄⁺对花青素的积累也有抑制作用；Yazaki等(1999)在紫草(Arnebia euchroma)的细胞培养中发现NH₄⁺对紫草色素合成有强烈的抑制作用。而本试验的结果同样显示，NO₃^-略高于NH₄⁺对白桦三萜积累比较有利。原因在于适宜的铵态氮和硝态氮的比例能够有效地减少愈伤组织褐化，从而促进生长。

3.3 不同植物生长调节剂配比对白桦愈伤组织生长及三萜积累的影响

不同植物生长调节剂下培养的愈伤组织在形态结构、生长能力、分化方向、次生代谢产物的合成能力等方面有很大的差异(邓冬青等，2004)。植物生长调节剂能够改变植物的生理代谢，通过添加不同的外源植物生长调节剂能够导致次生代谢物的改变，一般而论，次生物质在细胞中的积累与细胞初生代谢是相冲突的(何庆元等，2007)。这与本试验结果一致。本试验表明不同植物生长调节剂对白桦愈伤组织的生长及其三萜积累的影响是不同的，具体表现为0.4 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 TDZ组合对愈伤组织鲜质量的增长最有利，但不利于三萜的积累；而0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1 NAA组合对白桦愈伤组织的生长虽不及前者，但却是三萜积累量最高的，这表明白桦次生代谢物三萜的积累和细胞分裂生长并不是完全同步进行的。Takeda(1998)也发现，细胞的生长越快，花青甙的积累越少。陈学森等(1997)研究也表明，愈伤组织生物产量越高，黄酮在愈伤组织中的含量越少。由此可见，愈伤组织生长量与组织中活性物质含量的关系还有待于进一步深入研究。

不同种类和浓度的植物生长调节剂对次生代谢物积累的影响也有所不同。Fett-Neto等(1994)的研究表明，添加较低浓度的细胞分裂素(小于1 mg·L^-1))和较高浓度的2，4-D(1~8 mg·L^-1)有利于愈伤组织的生长。甘烦远等(2000)研究表明，低浓度的2，4-D(0.5~1.0 mg·L^-1)更适合于紫杉醇的合成，而较高浓度的2，4-D(1.0~2.5 mg·L^-1)，则较适合于红豆杉(Taxus)细胞的生长。Ketchum等(1995)的研究结果显示，使用NAA时紫杉醇的产量变化与使用2，4-D的结果相差不大，而使用IAA比2，4-D更能有效地提高紫杉醇的产量。本试验中0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1 NAA组合对白桦愈伤组织的生长不是最为有利的，但却是三萜积累量最高的。说明适宜浓度的6-BA和NAA组合对白桦三萜积累比较有利。

根据上述试验结果，初步选出对白桦愈伤组织生长及其三萜积累均适宜的培养条件为：IS+0.8 mg·L^-1 6-BA+0.6 mg·L^-1NAA。