松材线虫病是以病原松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)为主导的复杂的危险性森林病害(张星耀等，2003)，该病发病迅速，致病力强，防治十分困难(蒋平，2000；秦复牛等，2003；朱克恭，1995)。国内外许多学者对松材线虫病进行了大量研究，但到目前为止还没找出经济有效的防治方法。因此，人们试图从各个可能的方向进行研究，寻找突破，从物理学的角度探寻松材线虫病的防治方法是其中一个重要的研究内容。

生物体受到电作用后其生命活动会受到影响，有关研究证明，引起人体组织生理效应和损伤的直接原因是电流而非电压(李晓东，2004)。目前已有人制造出高压脉冲发生装置，但从森林保护学角度系统深入地用于森林有害生物的很少。本文针对松材线虫，以高压脉冲电流为技术手段，从有害生物控制及电生物学特性角度研究了高压脉冲电流对松材线虫活力和繁殖效应的影响，逐步探寻能有效影响松材线虫活力和繁殖能力的高压脉冲处理方法。

1 材料与方法 1.1 高压脉冲发生装置

本试验采用的高压脉冲发生装置自制，采用8节5号干电池作为电源。高压脉冲发生装置输出的电压主要由电源电压，负载电阻和脉冲宽度决定，可自标准曲线查得。

1.2 试验材料及制备

松材线虫分离于浙江省舟山市朱家尖感染松材线虫病的马尾松(Pinus massoniana)，在室内用盘多毛孢(Pestalotia sp.)培养繁殖，贝尔曼漏斗法分离，2 000 r·min^-1离心5 min，弃上清液，浓缩收集线虫(赵博光等，2006)，混合消毒法表面消毒(杨宝君等，2003)，以无菌去离子水为介质配成松材线虫液，显微镜下观察测算单位体积松材线虫液的线虫总量和2龄、3龄、4龄幼虫，雌虫和雄虫的线虫数目(重复10次得平均数)。

黑松(Pinus thunbergii)源自中国林业科学研究院院内，胸径25 cm。于2006年6月天气晴朗的上午采集黑松4年生枝，松枝直径0.8 cm。用流水清洗枝条表面，洗净后在水中剪成4 cm长的小段，擦干，备用。

1.3 试验方法 1.3.1 试验设计

1) 高压脉冲电流对松材线虫生存的影响  采用正交试验设计，按正交表L₉(3⁴)进行试验配比。试验因子分别为脉冲宽度：1.5，3和4.5 ms共3个水平；电处理间隔：1，3和5 min共3个水平；脉冲个数：2、17和32个共3个水平；设无电处理为对照。各处理重复3次。脉冲间隔28 ms，处理12 h。

2) 高压脉冲电流对松材线虫活动能力的影响  根据高压脉冲电流对松材线虫生存影响的结果，脉冲宽度分别设置为0.5、1、2、3、4、5和6 ms；设无电处理为对照。各处理重复3次。脉冲间隔28 ms，电处理间隔1 min，脉冲个数32个。

3) 高压脉冲电流对松材线虫繁殖的影响  采用完全随机区组试验设计，试验因子包括脉冲宽度：0.5、1、2和3 ms共4个水平；电处理时间：10、30、60和210 min共4个水平；设无电处理为对照。各处理重复3次。脉冲间隔28 ms，电处理间隔1 min，脉冲个数32个。

4) 高压脉冲电流对松材线虫迁移扩散的影响  采用正交试验设计，按正交表L₉(3⁴)进行试验配比。试验因子包括脉冲宽度：0.5、1.5和3 ms共3个水平；电处理间隔：1、5、10 min共3个水平；脉冲个数：2、17和32个共3个水平；设无电处理为对照，各处理重复3次。

1.3.2 试验过程

1) 高压脉冲电流对松材线虫生存、活动能力和繁殖的影响  取松材线虫液1.4 mL(142条·mL^-1)放入圆柱状容器中，不锈钢片状电极由容器两端插入松材线虫液底部，电极间距离2.5 cm。用motech mt 4080D型电桥测定试验线虫液阻抗值范围为95~110 kΩ。将电极与高压脉冲发生装置连接，进行处理。

培养盘多毛孢，待菌丝长满备用。处理结束后，根据Kawazu等(1980)的棉球法，将松材线虫液放到长满盘多毛孢PDA平板中央的灭菌棉球上，25 ℃培养室内暗培养，5 d后用贝尔曼漏斗法分离，在显微镜下观察测算松材线虫数量。

根据输出电压，6 ms脉冲宽度作用时电流为(0.05±0.002 5) A；5 ms脉冲宽度作用时电流为(0.046±0.001 5) A；4.5 ms脉冲宽度作用时电流为(0.04±0.001 5) A；4 ms脉冲宽度作用时电流为(0.038±0.001 5) A；3 ms脉冲宽度作用时电流为(0.032±0.001 5) A；2 ms脉冲宽度作用时电流为(0.025±0.001) A；1.5 ms脉冲宽度作用时电流为(0.022±0.001) A；1 ms脉冲宽度作用时电流为(0.017±0.001) A；0.5 ms脉冲宽度作用时电流为(0.013±0.001) A。

2) 高压脉冲电流对松材线虫迁移扩散的影响  将不锈钢针状电极垂直插入距松枝上端1 cm处，另一电极垂直插入距松枝下端1.5 cm处，插入深度0.3 cm，两电极间呈180°，电极间的距离为1.5 cm。将2 cm长的乳胶管套在松枝的上端，取灭菌后的脱脂棉放到乳胶管内，滴入1 mL松材线虫液(幼虫61.3%，其中2龄11.7%；3龄18.2%；4龄31.5%；成虫38.7%，其中雌虫22.1%，雄虫16.6%；密度150条·mL^-1)，乳胶管上端用脱脂棉塞上保湿。将松枝下端插到放有无菌水的容器中，插入深度为1 cm。用motech mt 4080D型电桥测定松枝阻抗值为6~7 kΩ。将电极与高压脉冲发生装置连接好，进行处理。处理持续88 h，脉冲间隔28 ms。每2 h时收集1次水液，显微镜下观察测算松材线虫数量及虫龄。停止电处理，放置24 h，再观测1次。

根据输出电压，3 ms脉冲宽度作用时电流为(0.057±0.001) A；1.5 ms脉冲宽度作用时电流为0.04±0.001 A；0.5 ms脉冲宽度作用时电流为(0.028±0.001) A。

1.3.3 试验指标测定

1) 用针刺法(谈家金等，2003)判定松材线虫的死活，采用校正死亡率评价松材线虫生存状况。

2) 定时统计电处理过程中松材线虫的假死率和死亡率并记录相应的电处理时间。当95%以上松材线虫出现假死时，将松材线虫静置于解剖镜下并观察虫体的恢复情况，记录最早恢复正常活动的虫体的虫龄和所需时间及所有虫体趋于正常所需时间。

3) 以校正繁殖抑制率评价高压脉冲电流对松材线虫繁殖的影响。若处理后分离线虫数≤接种数量，则校正繁殖抑制率I(%)＝100；若处理后分离线虫数>接种数量，则校正繁殖抑制率I(%)＝[1-(处理后分离线虫数－接种数)/(对照线虫数－接种数量)]×100%。

4) 采用校正迁移抑制率和平均迁移率评价松材线虫迁移情况。

虫龄的判断采用热杀死形态及体长法(叶为民等，1993)。

2 结果与分析 2.1 高压脉冲电流对松材线虫生存的影响

脉冲宽度、电处理间隔和脉冲个数对松材线虫生存的影响结果见表 1。从表 1可以看出，以松材线虫校正死亡率分析高压脉冲电流对松材线虫生存的影响，不同处理程度不同地表现出死亡现象。根据R的大小，影响因子的主次顺序为：脉冲宽度>脉冲个数>电处理间隔，脉冲宽度是主要影响因子。

图 2为脉冲宽度、电处理间隔和脉冲个数不同水平与松材线虫平均校正死亡率的曲线图。由图 2可知，脉冲宽度越大，松材线虫平均校正死亡率越高，脉冲宽度最佳水平为4.5 ms；电处理间隔越短，松材线虫平均校正死亡率越高，电处理间隔最佳水平为1 min；脉冲个数越多，松材线虫平均校正死亡率越高，脉冲个数最佳水平为32个。

2.2 高压脉冲电流对松材线虫活动能力的影响

松材线虫受到高压脉冲电流作用后，身体出现活动迟缓、扭动受阻、假死等活动能力异常现象，停止电处理，静置一定时间后，松材线虫的活动能力会逐渐恢复。试验结果见表 2。

从表 2可见，2 ms[电流为(0.025±0.001) A]以上的脉冲宽度可有效杀死松材线虫，抑制其活动能力。脉冲宽度越大，杀死松材线虫所需的时间越短，假死发生越早，虫体复原所需时间越长。4 ms[电流为(0.038±0.0015) A]，5 ms[电流为(0.046±0.0015) A]和6 ms[电流为(0.05±0.0025) A]脉冲宽度高压脉冲电流作用60 min可将松材线虫全部杀死，而3 ms脉冲宽度[电流为(0.032±0.0015) A]高压脉冲需240 min，2 ms脉冲宽度[电流为(0.025±0.001) A]高压脉冲需690 min以上，0.5 ms[电流为(0.013±0.001) A]和1 ms[电流为(0.017±0.001) A]脉冲宽度高压脉冲对松材线虫的致死作用并不明显，松材线虫死亡率和对照相近。结果表明，一定强度的高压脉冲电流作用一定的时间后才可有效杀死松材线虫，高压脉冲电流的作用时间也为影响松材线虫生存和活力的主要影响因子。

2.3 高压脉冲电流对松材线虫繁殖的影响

短时间的高压脉冲电流作用并不会导致松材线虫死亡，以校正繁殖抑制率来分析高压脉冲电流对松材线虫繁殖的影响，结果如图 3所示。

由图 3可知，不同脉冲宽度，松材线虫校正繁殖抑制率随处理时间的变化趋势相似，处理时间越长，松材线虫校正繁殖抑制率越高；相同处理时间，松材线虫校正繁殖抑制率随脉冲宽度的变化趋势相似；脉冲宽度越大，松材线虫校正繁殖抑制率越高。

脉冲宽度和处理时间影响松材线虫校正繁殖抑制率的方差分析见表 3。从表 3可知，2个因子对松材线虫校正繁殖抑制率的影响都达到极显著水平。说明脉冲宽度和处理时间对松材线虫的繁殖影响都很大。分别对脉冲宽度和处理时间各水平间采用q检验进行多重比较，结果表明，脉冲宽度3 ms[电流为(0.032±0.001) A]，2 ms[电流为(0.025±0.001) A]，1 ms[电流为(0.017±0.001) A]的校正繁殖抑制率与脉冲宽度0.5 ms[电流为(0.013±0.001) A]在0.05水平上差异极显著；电处理时间210和60 min的校正繁殖抑制率与电处理时间30和10 min都达到极显著或显著水平。

2.4 高压脉冲电流对松材线虫迁移扩散的影响

松材线虫受到高压脉冲电流作用后，不同处理程度不同地表现出松材线虫迁移受阻。试验结果如表 4所示。

表 4表明，以校正迁移抑制率评价高压脉冲电流对松材线虫迁移扩散的影响，不同处理对松材线虫迁移扩散的影响不同，校正迁移抑制率为86%~100%，处理5和7的校正迁移抑制率都达到100%。根据R的大小，影响因子的主次顺序为：电处理间隔>脉冲个数>脉冲宽度，电处理间隔为主要影响因子。

图 4表明，脉冲宽度不同水平试验结果相近，脉冲宽度越大，松材线虫校正迁移抑制率越高；电处理间隔越短，松材线虫校正迁移抑制率越高；脉冲个数越多，松材线虫校正迁移抑制率越高。

脉冲宽度、电处理间隔和脉冲个数影响松材线虫校正迁移抑制率的方差分析见表 5。表 5表明，3个因子中只有电处理间隔对松材线虫的平均迁移抑制率达到显著水平，进一步说明电处理间隔为高压脉冲电流影响松材线虫迁移扩散的主要因子。对电处理间隔各水平采用q检验进行多重比较，结果表明，电处理间隔1 min和5 min的校正迁移抑制率都与电处理间隔10 min达显著水平。

从表 4可见，不同处理中最先游出黑松枝条的松材线虫所需时间不同。对照中的松材线虫最快只需2 h就可游出，而有高压脉冲电流作用时，松材线虫最快游出黑松枝条所需时间相对较长，这主要和电处理间隔有关。电处理间隔为1 min的处理中，松材线虫最快要26 h才可游出，而电处理间隔为10 min的处理中，松材线虫最快6 h就可游出，从最快游出的松材线虫虫龄来看，主要为3，4龄幼虫，偶有成虫。

不同龄期的松材线虫对高压脉冲电流的反应不同。统计各因子不同水平的合计游出的松材线虫的虫龄比例，脉冲宽度是0.5 ms的处理中，成虫比例高于幼虫；脉冲宽度是1.5 ms的处理中，幼虫比例高于成虫；脉冲宽度是3 ms的处理中，幼虫比例高于成虫比例。电处理间隔是1 min的处理中，成虫比例高于幼虫；电处理间隔是5 min的处理中，幼虫比例高于成虫；电处理间隔是10 min的处理中，幼虫比例高于成虫。脉冲个数是2个的处理中，幼虫比例高于成虫；脉冲个数是17个的处理中，幼虫比例高于成虫；脉冲个数是32个的处理中，幼虫比例等于成虫。合计1~9号处理的游出的松材线虫的虫龄比例为幼虫54.5%，其中2龄0%，3龄25.0%，4龄29.5%；成虫45.5%，其中雌虫40.9%，雄虫4.6%。无电处理的对照中，游出的松材线虫虫龄比例为幼虫76.1%，其中2龄3%，3龄28.1%，4龄45.0%；成虫23.9%，其中雌虫15.5%，雄虫8.4%。而接种用的松材线虫虫龄比例为幼虫61.3%，其中2龄11.7%，3龄18.2%，4龄31.5%；成虫38.7%，其中雌虫22.1%，雄虫16.6%。由此可见，成虫对高压脉冲电流的抗性相对于幼虫更强，尤以雌虫更具抗性，但随着脉冲宽度增大，电处理间隔减短和脉冲个数增加，松材线虫成虫迁移能力受阻也越明显；高压脉冲电流对幼虫的迁移抑制作用更强，尤其是对2龄幼虫的迁移影响最明显，有高压脉冲电流作用时，无2龄幼虫游出黑松枝条。

由图 5可知，从平均迁移率来看，1至9号处理有高压脉冲电流作用时，松材线虫迁移率较低，最高为3条·(24 h)^-1，5号处理和7号处理无松材线虫游出；对照的松材线虫平均迁移率为19条·(24 h)^-1，说明高压脉冲电流可抑制松材线虫的迁移量；结束高压脉冲电流作用24 h后，所有处理都有松材线虫游出，说明黑松枝条取消高压脉冲电流作用后，松材线虫的迁移并不受到影响。

3 结论与讨论

高压脉冲电流可杀死松材线虫，脉冲宽度为主要影响电参数, 脉冲宽度越大，脉冲个数越多，电处理间隔越短，对松材线虫的杀死效果越好。4、5和6 ms脉冲宽度的高压脉冲电流作用60 min后就可将松材线虫全部杀死，而3 ms脉冲宽度高压脉冲则需240 min，2 ms脉冲宽度高压脉冲电流需690 min以上，而0.5 ms和1 ms脉冲宽度高压脉冲电流对松材线虫并无明显的致死或抑制作用。脉冲宽度越大，杀死松材线虫所需的时间越短，假死发生越早，虫体复原所需时间越长。

松材线虫对高压脉冲电流具有一定的抗性，短时间的高压脉冲电流作用不会导致松材线虫死亡，但可抑制松材线虫的繁殖能力。

高压脉冲电流可抑制松材线虫在黑松枝内的迁移扩散能力，电处理间隔是影响松材线虫迁移的主要电参数。电处理间隔越短，脉冲个数越多，脉冲宽度越大，松材线虫校正迁移抑制率越高。不同龄期的松材线虫对高压脉冲电流反应不同，成虫对高压脉冲电流的抗性更强，尤以雌虫更具抗性，幼虫对高压脉冲电流更敏感，尤其是2龄幼虫。

不同生物体对电流作用的承受能力不同，电对生物体的影响效应也不同。本试验针对松材线虫病的病原——松材线虫，研究了其对电流的承受力，而缺少对松材线虫病的其他相关生物因子的研究。高压脉冲电流技术应用于松材线虫病防治的可行性及效果需要对松材线虫病的其他相关生物因子的研究为基础。此次试验结果为高压脉冲电流应用于松材线虫病的防治提供了重要参考。