随着世界人口的不断增加和耕地的不断减少，人类蛋白质资源已面临短缺危机。目前我国人均膳食中动物性蛋白质的摄取量与世界水平相差甚远，仅相当于经济发达国家的1/5~1/8(周光召, 1997; 魏美才等, 2001)。因此，在当前形势下开发新的动物蛋白质资源具有重要意义。

昆虫是地球上生物中种类最多、数量最大的生物类群，是目前最大的未被充分利用的宝贵资源(文礼章, 1998; Ramos-Elorduy et al., 2002; Maiti et al., 2001)，其虫体本身蕴藏着高含量的优质动物蛋白，而且其虫体蛋白质中氨基酸组分分布的比例与联合国粮农组织(FAO)制定的蛋白质中必需氨基酸的比例模式非常接近(文礼章, 1998; 魏美才等, 2001)。因此昆虫被认为是目前最大且最具开发潜力的动物蛋白质来源。

松毛虫(Dendrolimus spp.)是我国最严重的森林大害虫，堪称不冒烟的森林火灾(狄升, 1995)；但从资源学的角度来看，松毛虫又是一类巨大的生物资源。前期研究结果表明，松毛虫中含有50%~65%的优质蛋白质(刘高强等, 2003)，我国云南的少数民族地区和国外部分国家如日本和朝鲜的一些人们常把松毛虫蛹当作一种食物来食用(何剑中等, 1998a)。这些食虫事实和松毛虫巨大的资源特点为人们开发松毛虫新资源蛋白系列食品给予了启示。中国林业科学研究院资源昆虫研究所对云南松毛虫(D.houi)、思茅松毛虫(D.vikuchii)、德昌松毛虫(D.punctatus tehchangensis)等进行了资源化利用研究(何剑中等, 1998b; 1998c)。笔者近年来研究了马尾松毛虫(D.punctatus)毒素的性质后，采用加热处理的方法解决了马尾松毛虫毒素对其开发利用的制约问题(刘高强等, 2003；2005)，随后研究了马尾松毛虫蛹甲壳素的提取工艺(刘高强等, 2007)，并对马尾松毛虫幼虫蛋白质的提取进行了初步研究(刘高强等, 2006)。本文则在前期研究的基础上，进一步采用缓冲液法提取了马尾松毛虫幼虫中的总蛋白质，对所得产品蛋白质的营养价值和食用安全性进行评价。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器

马尾松毛虫幼虫，采自湖南东安县地区。样品在真空干燥箱内于40 ℃下烘干备用。

日立835-50型氨基酸自动分析仪，日本日立公司；DZF-1型真空干燥箱，上海跃进医疗器械厂生产；pHS-25型精密pH计。

1.2 试验方法 1.2.1 提取工艺

参考相关文献(郭勇, 1996; 鲁晓翔等, 1999)和预试验确定，马尾松毛虫幼虫蛋白质的基本提取工艺如下：虫体干燥→制浆→溶剂抽提→离心分离→调等电点→离心分离→粗蛋白质→透析除杂→较纯蛋白质→干燥成品。每次准确称取5.65 g样品，按照基本工艺流程进行蛋白质的提取。

1.2.2 蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法(宁正祥, 1997)测定。

1.2.3 总氮提取率的计算

总氮提取率：蛋白产品中含氮量/原料中含氮量=蛋白产品质量×品粗蛋白含量/原料质量×料粗蛋白含量。

1.2.4 氨基酸组成的测定

样品经6 mol·L^-1 HCl水解后，采用日立835-50型高速氨基酸分析仪进行17种蛋白质构成氨基酸的分析。另取样用5 mol·L^-1 NaOH水解后，采用同机测定其色氨酸含量。

1.2.5 氨基酸价的计算 1.2.6 产品的安全性评价

采用急性毒性试验法(周宗灿, 2006)。预试验：选取健康的小白鼠16只，体重均为(20±2)g，雌雄各半，随机分为4组，每组4只。通过灌胃经口给予受试物。观察各组小鼠的反应、表现和死亡情况以估计正式试验的剂量。正式试验：根据预试结果设计剂量，分5~6个剂量组，每组小鼠10只。通过各组小鼠的死亡数目来计算受试物的半数致死量(LD₅₀)，从而判断受试物毒性的大小。

1.3 试验设计

本试验采取单因素试验法。测定某一因素时，表 1中其他条件为非测定因素。经预试验后，选择的缓冲液为Na₂HPO₄-NaOH(pH为9.5)。单因素试验的基本条件：料液比为1:20(m:v)，原料粗细度：原干虫体；提取时间为3 h，提取温度为25 ℃；沉淀pH为5.0，沉淀温度为5 ℃，沉淀时间为2 h。

1.4 统计分析

每组试验重复3次，结果为平均值±标准偏差。数据处理采用SAS 8.1软件。

2 结果与分析 2.1 单因素试验结果

单因素提取马尾松毛虫幼虫蛋白质的结果见表 2。显著性分析结果表明，原料粗细度、提取温度、提取时间对提取结果差异显著，沉淀pH差异极显著，而料液比、沉淀温度和沉淀时间对提取结果无显著差异。

从表 2可看出，原料粗细度以40目虫粉进行匀浆为宜；提取温度、提取时间以及沉淀pH都与蛋白产品的产量正相关，故提取温度取40 ℃、提取时间取5 h；沉淀pH中，5.0的产量最高，故沉淀pH应以5.0为宜。

料液比、沉淀温度和沉淀时间对提取结果差异不显著，但综合考虑生产实际与产量的关系，料液比以1:15为宜；沉淀温度和沉淀时间分别以5 ℃和1 h为宜。

2.2 单因素试验的验证

在单因素试验确定的最佳条件下进行3次重复提取，所得蛋白产品干质量为(2.41±0.04)g，其粗蛋白含量为(71.12±0.16)%，总氮提取率为(60.36±1.25)%(表 3)。与以前稀碱法提取方法相比，所得蛋白产品的粗蛋白含量较低[稀碱法所得产品的粗蛋白含量为(81.03±0.14)%]，但总氮提取率大大提高[稀碱法的总氮提取率为(41.27±2.00)%] (刘高强等, 2006)。因此，总体来看，采用缓冲液法对马尾松毛虫幼虫中的蛋白质进行提取，方法更好，也更具有实用价值。

2.3 蛋白质产品的氨基酸组成分析

对最优条件下提取的蛋白质产品进行氨基酸组成分析，结果见表 4。由表中可见，所得蛋白产品中，18种氨基酸齐全。其中氨基酸总量为69.58%；必须氨基酸总量为31.42%(含婴儿必需氨基酸组氨酸)(刘志皋, 2004)，占氨基酸总量的45.16%。

表 5为蛋白产品中必需氨酸组成和FAO/WHO必需氨酸标准模式的比较。从表中可知，第一限制氨基酸为含硫氨基酸，其氨基酸价为97。但含硫氨基酸中的胱氨酸在盐酸水解条件下，易受破坏，故其实际值应比测定值高。其他必需氨酸的氨基酸价都在100以上，所以，本试验所得蛋白质产品的营养价值较高，是一种优质动物蛋白源。

2.4 蛋白质产品的急性毒性试验

蛋白质产品的急性毒性试验结果见表 6。本预试验采用1 d内多次经口给予小鼠药物的方式，最大剂量已达10 000 mg·kg^-1以上(12 050 mg·kg^-1)，结果无小鼠死亡和其他异常症状，连续观察2周后也无小鼠死亡。这表明该蛋白产品的LD₅₀在10 000 mg·kg^-1以上，属实际无毒范围，根据相关规定(周宗灿, 2006)，无需进一步进行正式试验。

3 结论与讨论

蛋白质的提取方法较多，如稀碱法、酶法、稀盐法以及缓冲液法等(郭勇, 1996; 陈来同等, 1997)。但缓冲液法提取蛋白质简单易行，且无食品安全隐患，因此本文采用缓冲液法对马尾松毛虫幼虫进行了蛋白质的提取研究。结果表明，采用此法进行松毛虫幼虫蛋白质的提取是可行的，与以前试验的稀碱法相比(刘高强等, 2006)，本法提取效果更好，总氮提取率更高。同时产品氨基酸分析结果表明，所得蛋白产品中，18种氨基酸齐全。其中氨基酸总量为69.58%；必须氨基酸总量为31.42%(含婴儿必需氨基酸组氨酸)(刘志皋, 2004)，占氨基酸总量的45.16%。表明该蛋白产品有较高的营养学价值。急性毒性试验结果表明，该蛋白产品的LD₅₀在10 000 mg·kg^-1以上，属实际无毒范围，这为产品的进一步开发提供了安全方面的依据。

向洋等(1999)对家蛆幼虫中的蛋白质进行了提取，所用方法为稀碱法，与本文不同。本文结果表明，提取松毛虫蛋白质时，缓冲液法提取效果优于稀碱法，蛋白质提取率为60.36%；而该文献中报道的蛋白质得率仅为39.07%，可能与所采用方法不同有关。冀宪领等(2000)研究了黄粉虫(Tenebrio molitor)中蛋白质的提取工艺，采用稀碱法和盐法2种方法提取，结果表明盐提法的提取效果更好，提取率为69.38%，比本文缓冲液法提取马尾松毛虫幼虫中蛋白质的提取率(60.36%)较高，这种差异可能与原材料和提取方法都有关。

总体来看，目前昆虫蛋白质的开发利用研究尚少，大多研究集中在昆虫营养成分的测定方面。而且已有昆虫蛋白质的开发研究，尚未用缓冲液法进行蛋白质的提取，本文的提取结果可为今后马尾松毛虫蛋白系列产品的研发提供技术参考。今后仍需要采用正交设计或响应面设计法对提取工艺进行优化，以进一步降低成本和提高提取率。