松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum)为农业部公布进境检疫性有害生物名单中新增加的病原真菌，该病菌1946年于美国北卡罗莱那州矮松(Pinus virginiana)上首次发现(Hepting et al., 1946)。近年来，松树脂溃疡病菌在世界各地呈现迅速蔓延之势，1989年日本、1991年墨西哥、1994年南非、2001年智利等地相继发现(廖太林等，2007)。以美国南方种子园内湿地松(P. elliottii)、加利福尼亚州辐射松(P. radiata)、加州沼松(P. muricata)、瘤果松(P.attenuata)以及南非展叶松(P. patula)上为害最为严重，引起树干流脂溃疡、雌花和球果坏死、种子变质以及苗木枯死(Viljoen et al., 1994；Gordon et al., 2001；廖太林等，2004)。

因该菌培养过程不产生厚垣孢子和链状小型分生孢子，松树脂溃疡病菌最早被认为是砖红镰刀菌(F. lateritium)(Snyder et al., 1949)。随着Booth引入瓶梗作为镰刀菌重要分类特征，因可产生单瓶梗和复瓶梗其又被认为是串珠镰刀菌胶孢变种(F. moniliforme var. subglutinans)(Kuhlman et al., 1978)。通过对胶孢镰刀菌(F. subglutinans)松树与其他寄主上分离物致病性研究表明，松树上分离物间明显具有寄主专化性；mtDNA的RFLP研究也表明，松树脂溃疡病菌为胶孢镰刀菌在松树上的一个专化型，即胶孢镰刀菌松树专化型(F. subglutinans f. sp. pini)(Correll et al., 1991)。Nirenberg等(1998)综合镰刀菌形态和分子生物学等方面的研究，认为松树脂溃疡病菌为单独的一个种，并将其命名为Fusarium circinatum。松树脂溃疡病菌为李瑟组镰刀菌(Fusarium section)的一个种，其有性阶段为Gibberella fujikuroi (sawada) Ito & Kimura中的交配群H(Steenkamp et al., 1999)。除上述交配群(生物学种)外，G. fujikuroi至少还包括另外7个在遗传上完全不同的交配群，分别以A、B、C、D、E、F、G命名(Britz et al., 1999)。本文应用AFLP标志技术对松树脂溃疡病菌及其近缘种多态性进行分析，试图能找出交配群H与其他交配群间亲缘关系，确定区分不同交配群的特异带和差异带，为松树脂溃疡病菌分类鉴定提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

松树脂溃疡病菌由美国应用农业研究中心(NUACR)提供，李瑟组镰刀菌交配群A、B、C、D、E、F及其他对照菌株由南京农业大学植物病理教研组(NJAU)提供(表 1)。

1.2 试验方法 1.2.1 菌株培养和菌丝体收集

同廖太林等(2007)的方法。

1.2.2 菌丝体基因组DNA的抽提

参照Ausubel等(1998)的CTAB法。

1.2.3 模板DNA浓度及纯度检测

取10 μL DNA溶液，用1×TE(pH8.0)稀释至2 mL，在紫外分光光度计上测定波长260 nm和280 nm的光吸收值(OD值)，根据公式：样品DNA浓度(ng·μL^-1)=50×OD₂₆₀×稀释倍数，计算样品DNA的浓度。根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值判断DNA的纯度。

1.2.4 AFLP的分析

AFLP分析过程基因组DNA消化、接头连接、预扩增以及选择性扩增程序按AFLP试剂盒Ⅱ操作说明进行。试剂盒由美国Invitrogen公司生产。

1.2.5 电泳

选择性扩增产物经变性后在变性聚丙烯酰胺序列分析胶上电泳分离, 条件是55℃，1 200 V，100 W，约4.5 h。电泳后采用Tixier等(1997)的银染检测方法进行AFLP指纹显色反应。

1.2.6 结果记录

数据以如下方式记录：有带的记为“1”，无带的记为“0”，数据缺失或条带模糊的记为“2”。

1.3 数据统计分析

参照周延清(2005)方法进行数据统计分析。多态性：多态性(%)=扩增多态性片段数/总扩增片段数×100%=(N_i+N_j-2N_ij)/(N_i+N_j-N_ij)，式中，N_ij代表样本i和j的公共条带，N_i、N_j分别是样本i、j的带数。相似系数：采用简单匹配系数(S_sm)计算相似系数，其计算公式为S_sm=(N_ij+N₀)/(N_i+N_j+N_ij+N₀)，式中，N_i、N_j、N_ij同上，N₀代表样本i和j均无的带。聚类分析：利用NTSYSpc分析软件，采用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类。

2 结果与分析 2.1 多态性引物的筛选

从试剂盒中提供的64对引物对，筛选到10对在镰刀菌中有较高多态性的引物组合(表 2)，其扩增的谱带在凝胶上均匀分布，且各条带之间的亮度相当。

2.2 AFLP多态性分析

用10对AFLP引物组合对供试样品进行分析，共检测到了298个标记，其中多态性标记283个，多态位点的百分率为94.97%；每对引物组合产生的多态性标记数量不等，最少的是检测到24条谱带，最多的是检测到33条谱带，平均每对引物组合扩增出28.3条谱带，多态性位点的百分率在89.29%~100%之间(表 3)。引物组合E-TG/M-CTA和E-TG/M-CTC对每个镰刀菌菌株扩增产生的标记位点见图 1。

2.3 镰刀菌属种及种内遗传变异

根据10对引物扩增结果，计算供试菌株间相似系数。由此数据计算得到各李瑟组镰刀菌种间以及松树脂溃疡病菌种群间相似系数变幅及其均值。菌株之间的相似系数为0.477 1~0.984 7，平均相似系数为0.624 2；李瑟组镰刀菌株之间的相似系数为0.520 8~0.984 7，均值为0.646 7。种内种群间的相似系数较大，如交配群A的2个种群的相似系数为0.984 7，交配群C的2个种群的相似系数为0.980 4，交配群D的2个种群的相似系数为0.947 9，交配群E的3个种群的相似系数变幅为0.899 6~0.961 5，交配群H的4个种群的相似系数变幅为0.797 2~0.902 4。

2.4 聚类分析

用各菌株间的遗传相似系数，采用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析(图 2)，结果17个供试菌株在遗传相似性系数0.58处可将李瑟组镰刀菌与F. graminearum、F. solani进行区分，李瑟组镰刀菌各交配型间的遗传相似性较高。在遗传相似性系数0.65处可将李瑟组镰刀菌划分3个遗传相似组，其中交配群A和B为一组，交配群C、D和F为一组，交配群E和H为一组。在遗传相似性系数0.79处可进一步对李瑟组镰刀菌不同交配型完全分开，上述菌株间的聚类分析结果与生物学种的分类结果一致。

2.5 差异带鉴定

在应用引物E-AT/M-CAA构建的李瑟组镰刀菌AFLP指纹图谱中，供试的交配群A(340 bp)、交配群E(700 bp)、交配群H(380 bp)均有特异带。其他供试的李瑟组镰刀菌可以采用二歧分类法确定各自在该AFLP图谱中的差异带，根据各自的特异带或差异带可以将该组供试的李瑟组镰刀菌7个交配群进行区分。上述条带一旦被确认为具有菌种的特异性，即可通过特征指纹快速鉴定李瑟组镰刀菌，从而大大提高鉴定效率。

3 结论与讨论

利用10对AFLP引物组合对李瑟组镰刀菌中的交配群A、B、C、D、E、F、H以及F. graminearum、F. solani等9种17个菌株进行分析，检测到的多态位点为94.97%，表明供试菌株在分子水平存在广泛变异。聚类分析结果表明，在李瑟组镰刀菌中交配群C、D以及F间亲缘关系较近，交配群E、H间亲缘关系较近。该研究结果与O'Donnell等(1998)以β-微管蛋白基因和线粒体DNA碱基序列、Steenkamp等(1999)以组蛋白H3编码基因的碱基序列聚类分析结果一致。由于交配群G在国内未见有发现的报道，而从国外引进又极其困难，本研究的供试材料缺少交配群G，导致研究结果无法全面反映李瑟组镰刀菌各种群间的亲缘关系。

松树脂溃疡病菌早期被归为交配群B，但从本研究的AFLP聚类分析结果来看，交配群B、H之间的遗传相似系数较小(< 0.60)(Swofford, 1998)。松树脂溃疡病菌在李瑟组镰刀菌中代表一个独立的交配群，该研究结果进一步证实了O'Donnell等(1998)和Britz等(1999)人的研究观点。不同地理来源松树脂溃疡病菌4个菌株间遗传差异较大，表明美国佐治亚州、北卡罗莱那州、南非以及日本的松树脂溃疡病菌已形成了相对独立的类群。

分子标记技术作为菌种鉴定技术要应用于生产实际, 必须满足重复性好、分辨率高、多态性强以及效率高等要求。本试验研究结果表明：AFLP技术是稳定可靠的, 引物E-AT/M-CAA对松树脂溃疡病菌及其相关种进行分析，检出31个标记中多态性标记有29个，被检测位点中93.55%位点种间存在差异。构建的李瑟组镰刀菌指纹图谱中，交配群A、交配群E、交配群H均有特异带，而其他供试李瑟组镰刀菌采用二歧分类法可确定各自在该AFLP图谱中的差异带，根据各自的特异带或差异带可对相关菌种进行鉴定。