人心果(Manilkara zapota)为山榄科(Sapotaceae)铁线子属常绿果树，原产墨西哥南部与中美洲地区(Morton，2000)，现在大部分热带、亚热带国家都有种植。人心果是一种果胶两用树种，其果实主要供鲜食，味道甜美, 芳香爽口，营养丰富。树体所分泌的胶液，称为“奇可胶”(chick)，是制造生态口香糖的胶基原料，有很好的开发利用价值。我国人心果最早于20世纪初从东南亚国家引种，主要分布于云南、广东、广西、福建、海南和台湾等省(区)的中南部。人心果在我国虽然已有上百年的引种历史，但仍属珍稀果树，资源稀少，良种缺乏，没有形成一定的生产规模(谢碧霞等，2005)。目前，除海南、广东有少量栽培外，人心果在其他地区零星分布，呈散生状态。就品种而言，我国目前尚无具体的品种名称，且各地对人心果的称呼也存在很大差异，同物异名、同名异物现象普遍存在，这给人心果的资源收集、种质鉴定、分类和引种带来了很大困难。

AFLP分子标记技术由荷兰科学家Zabeau等(1995)创立。该方法结合了RFLP和RAPD技术的特点，既具有PCR的高效性、安全性和方便性的特点，又具有RFLP可靠性好、重复性高的优点，已被广泛应用于植物亲缘关系、种质鉴别及遗传多样性研究(王利等，2008；王献等，2005；Zhang et al., 2000；宋红竹等，2007)。本文在人心果品种资源表型性状研究的基础上(文亚峰等，2006)，利用AFLP分子标记技术分析人心果品种资源的DNA指纹图谱，研究品种间的亲缘关系及其遗传多样性，为人心果品种资源收集、引进、分类和遗传改良提供科学依据。

1 材料和方法 1.1 试验材料

31个样品采自广西人心果种质资源圃、云南西双版纳热带植物园及广东湛江等地, 其中包括4个蔓妹人心果(Pouteria sapota)品种(C14、C15、C16、C17)。蔓妹人心果与人心果同属山榄科，2004年首次从美国佛罗里达州引种到我国，本试验中用作对照样本。所有样品均选取新鲜嫩叶5~10枚用冰盒带回实验室, 置于-80 ℃低温冰箱保存备用。材料编号、品种(类型)名称及来源见表 1。

1.2 试验方法

采用荧光AFLP(fluorescent-labeled AFLP)技术开展试验研究。该技术利用荧光染料标记引物进行选择性扩增，扩增产物在自动测序仪(ABI377)上扫描鉴定。所显示的AFLP带的式样为不同分子质量、不同荧光强度扩增片段的DNA指纹图谱，利用GeneScan和Gentyper软件分析多态性和基因型。

1.2.1 模板DNA的制备

利用CTAB法提取DNA，并略加以改进。用DU-640核酸蛋白仪对抽提的DNA进行纯度和浓度检测。DNA提取质量用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 根据检测结果将符合试验要求的DNA样品稀释到约100 μg·mL^-1用于AFLP试验。

1.2.2 AFLP试验方法

AFLP试验包括模板DNA的酶切-连接、预扩增、选择性扩增及扩增产物的电泳检测等。具体步骤参照美国Applied Biosystems公司的植物荧光AFLP操作指南，采用梯度试验确定并建立了人心果AFLP反应体系(文亚峰，2006)。

1.2.3 数据处理与分析

电泳结果数据由GeneScan3.7(Applied Biosystems)软件获得，所提供的数据为50~500 bp区间的DNA片断分子质量。由于小片段DNA杂带较多，选取75~500 bp区间的DNA片断，将分子质量数值转化为1，0标准数据，求多态性位点百分率P=(k/n)×100%。式中:K为多态性位点数目，n为所测定的位点数目。

利用NTSYS2.10e软件求Dice(Nei and Li's)相似性系数S_n=2a/(2a+b+c)，式中：a为两样品的共有条带数，b为A样品有、B样品无的条带数，c为B样品有、A样品无的条带数。根据求得的Dice遗传相似性矩阵, 对各品种资源进行聚类分析(UPGMA法)，生成聚类图。

1.2.4 表型标记与分子标记的相关性分析

根据人心果生物学特性和树体外部特征, 选取树姿、叶、花、果4大外部形态的20个外形指标作为标记特征, 观察并测定性状数值(特性数据)。结合人心果表型分析数据(文亚峰等，2006)，利用NTSYS2.10e软件中的Mxcomp程序对表型标记与分子标记结果的相关性进行Mantel检验。

2 结果与分析 2.1 扩增结果及多态性比例

所筛选的9个引物对共扩增得到1 131条带(75~500 bp, 表 2), 其中多态性带为1 096条，多态性比率达到了96.90%，平均每对引物产生125条带。引物P-GTA/M-CAG扩增效率最高，共产生140条带。引物P-GAC/M-CAA多态性比率最高, 为99.17%。如果去除4个曼妹人心果品种(C14、C15、C16、C17)，在种的水平上，人心果多态性比率达到了89.04%。但在品种水平而言，遗传变异有大有小，多态性比例在22.19%~45.89%之间(表 3)。

2.2 特征性条带

9对引物共扩增得到1 131条带，其中特征带(某品种独有)就有124条(表 2、3)，占扩增总带数的10.96%，特征带大小一般在350~500 bp之间。31个品种中有28个找到了特征性条带，其中蔓妹人心果的4个品种C14、C15、C16、C17特征带最多，共有43条，占总带的34.68%。此外，C19(广西2)特征带也较多，有11条。而C4(O-3)、C25(广西4)、C31(广西5)3个品种未找到特征带，相信随着筛选引物的增多，这3个品种肯定也有特征带存在。这些特征性条带在人心果品种鉴别及特异性状基因克隆中具有重要作用。

2.3 聚类分析

供试材料间的遗传相似性系数在0.40~0.87之间，平均相似性系数为0.65。C21与C22(海南3与海南2)之间的相似性系数最大, 为0.87，表明其亲缘关系最近，与表型性状分析结果一致，从分子角度分析来自海南的C21和C22可能为同一品种。根据遗传相似性系数矩阵按UPGMA法对31个品种资源进行聚类分析(图 1)。在相似性系数0.52处, 蔓妹人心果4个品种首先被区分开，聚为MAM类群，27个人心果品种全部聚为SAP类群。蔓妹人心果和人心果属于山榄科的2个不同属，聚类结果表明这2个属间存在较远的亲缘关系。在相似性系数0.54处, SAP类群又可分为SAP1和SAP2两个亚群。SAP1亚群由C26、C27、C28构成，为云南西双版纳和广东湛江的3个品种，其表型特征主要体现在嫩梢(嫩叶)为褐红色, 上密被褐毛。在相似性系数0.69处, SAP2亚群的24个人心果品种被分为4组(A、B、C、D组)。A组只包括C8一个品种；B组为C4和C29两个品种；C组为C19一个品种；D组的20个品种(类型)又可分为3个亚组(D-1、D-2和D-3)。D-1亚组只有C23一个品种；D-2亚组包括18个品种，大部分栽培品种聚在这一亚组；D-3亚组只含C1一个品种，形态表现为大果。

从分子聚类分析结果可看出，11个美洲品种和10个国内地方类型在相似性系数0.66处聚为一大组(C、D组)，表现出较近的亲缘关系，它们并没有按地理来源的不同聚类，而是互有穿插, 有些国内品种与美洲品种间的亲缘关系甚至高于本地品种。大部分栽培品种聚于D-2亚组，与国内其他地方类型(野生种)有一定的遗传距离，说明栽培种的来源较为相近，可能来自亲缘关系较近的几个母本。

2.4 表型标记与分子标记结果的相关性比较

根据NTSYS2.10e软件的Mantel检验结果(1 000次置换)，人心果表型标记(文亚峰等，2006)与分子标记之间的相关系数为0.198(P=0.057>0.05), 二者相关性并不高。但其中有少数品种，如海南的3个品种、云南西双版纳和广东湛江品种(类型)相互之间的形态与分子标记聚类结果完全一致，说明亲缘关系很近或很远(海南的3个品种相互间亲缘关系较近；云南西双版纳和广东湛江3个品种与其他品种间遗传距离较远)的品种间相关程度高。

3 讨论 3.1 人心果遗传多样性水平评价

人心果起源于墨西哥和中美洲地区，早在4 000~5 000年以前，古代玛雅人就有利用人心果的历史。在长期的进化和人工选择过程中，人心果形成了多种不同的种类和品种。由于其较好的经济用途，目前已被引种至大部分热带和亚热带地区，分布范围逐步扩大。AFLP研究结果表明，在种的水平(除蔓妹人心果)，人心果多态性比率达到了89.04%。根据Hamrick等(1990)利用等位酶研究植物遗传变异的结果，长命多年生木本植物的多态性比率为64.70%。可见在种的水平上，人心果体现了非常丰富的遗传多样性。

就品种(类型)水平而言，人心果的遗传变异有大有小，多态性比例在22.19%~45.89%之间，比荔枝(Litchi chinensis) (易干军等，2003)、龙眼(Dimocarpus longan)(谭卫萍，2002)等其他热带果树要低。这主要与各地的引种历史和栽培方式有关, 虽然在长期的进化和选择过程中，人心果种群在其起源地形成了丰富的多样性，但各地引种历史并不是很长，引进品种数量有限，栽培地域狭小，不同地区间品种交换少，外源基因交流的机会也少，因此变异程度不大。同时，长期的实生繁殖方式也限制了遗传变异的发生。

3.2 人心果表型与分子聚类结果的比较

形态学性状是植物品种最直观、可以进行描述的外部特征，尽管形态标记易受发育时期和环境条件影响，且标记数量有限，但形态标记简便易行且快速，长期以来被广泛应用于物种种质资源鉴定、分类和多样性研究。随着现代分子生物学技术的发展，分子标记可以使人们直接对决定生物性状的基因进行分析，有着非常独特的优越性。但形态标记和分子标记结果的一致性一直是争论较多的话题。在观赏桃花(Prunus persica)(Hu et al., 2005)、大花惠兰(Cymbidium hyridus)(朱根发等，2007)、菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)(Schnell et al., 2001)等植物研究中发现分子和形态标记结果较为相近，可以用分子标记来指导传统的分类研究。但更多的报道如油橄榄(Olea europaea)(Hagidimitriou et al., 2005)、葡萄(Vitis vinifera)(Martínez et al., 2003)、黑麦草(Lolium perenne)(Roladan-Ruiz et al., 2001)等是关于分子和形态标记结果间的不一致。Heaton等(1999)也曾运用RAPD技术对生长在墨西哥尤卡坦州不同地理环境条件(森林和沼泽)下的人心果种群进行研究，发现分子与形态标记结果差异非常大，但不同外部形态的人心果种群在基因型上并无显著差异，因此认为环境因素是引起形态差异的主要原因。本研究结果表明，人心果形态标记和AFLP分子标记聚类结果间的相关性并不高，但其中亲缘关系很近或很远的品种形态标记与分子标记间具有较高的相关性，这与Roladan-Ruiz等(2001)研究黑麦草时得到的结论相同。

可以从以下几个方面理解形态和分子标记结果的不一致性。首先与自然选择和环境等因素的影响有关。在生物进化过程中，自然选择能导致形态的迅速分化，此外，自然选择也可引起在进化上不同祖先的种群承受着某些特征的趋同，造成形态上的相似性，而且形态学特征也会受到环境因子、生物因子以及人类活动等因素的影响。相对而言，在种质鉴别上, 分子标记较形态特征有更大的优越性，如基因位点数量大，各位点之间相互独立，容易比较它们之间的差异以及可以完全排除环境因素的干扰等。就人心果而言，当它从中美洲地区被引种后，为适应不同地方的环境条件，虽然在形态上产生了一定的变异，但基因型并没有改变。

标记位点的选择和标记数量也是造成形态与分子标记结果不一致的主要原因。可能所选用的标记并没有较好地反映各样本之间实质性的差异。形态标记数量非常有限，一般选取能观察到的外部特征作为标记位点，而分子标记检测的基因位点数也只有几百至几千个。高等植物基因组包含有4~10万个编码蛋白质的基因，这些有限的分子标记位点不一定正好就是控制某一形态性状的结构基因，因此，产生形态与分子标记结果的不一致性是正常的，也是难以避免的。除此之外，样本数量、不同的分析方法、人为误差等也会在一定程度上造成形态与分子标记结果的不一致。目前，越来越多的研究表明，形态与分子标记的一致度既与物种的进化背景有关，也与物种生存环境、生态习性及标记方法本身有较大关系，可以根据研究目的不同而选用不同的方法。人们通常把多种标记方法结合起来使用，相互补充，相互完善，以求从不同层次、不同水平对生物系统进化过程做更完美的解释。

3.3 人心果品种及其分类

种是植物分类学上的基本单位，品种是在种以下划分出的生产资料。如果严格按照“品种"的概念，试验所选用的27人心果材料中，除美国的13个和我国海南4个栽培品种外，其他材料尚不能称为“品种"，最多只能算“地方类型"。根据笔者前期表型分析结果, 可初步将人心果分为几个大的类型(文亚峰等，2006)，但要对人心果品种进行系统分类，就必须在长期观察的基础上，寻找标记性状较为明显且能稳定遗传的质量或数量形态性状。结合形态标记与分子标记结果来看，嫩梢(叶)颜色可能为质量性状，适合作为分类依据。大部分栽培品种聚在D-2亚组，而地方类型(野生种)分布于其他不同的组内，这种差异可能与果实品质性状相关，分类研究时可重点考虑果实性状特征。就花器特征而言，虽然形态与分子聚类结果一致，但取样的海南3个品种亲缘关系过近，花器特征是否能作为分类依据，有待进一步观察。