谷氨酸可以作为养分被植物直接吸收利用(张青等，2005；彭勇等，2007)，而且近年来研究表明谷氨酸可作为信号分子调控植物的生长发育，推测谷氨酸受体蛋白可能参与其信号转导过程(Walch-Liu et al.，2006)。在动物中，离子型谷氨酸受体(iGLuRs)是神经系统中胞间通讯的关键组分，能作为非选择性配体门控的阳离子通道而起作用。根据它们的配体选择性及离子电导特性，iGluRs可以分为3个功能亚组，分别为AMPA受体、KA受体和NMDA受体。已确定的动物iGluRs包含6个具有重要功能的保守结构域，其中包括2个与大肠杆菌的谷氨酰胺结合蛋白(GlnH)有相似性的配体结合结构域S1、S2，3个跨膜结构域M1、M3、M4及一个凹膜结构域M2(Dingledine et al.，1999；Madden，2002)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)上已成功克隆20个谷氨酸受体基因(AtGLRs)，并根据序列的同源性分为3个亚家族(Chiu et al.，2002；Lacombe et al.，2001)；Li等(2006)在水稻(Oryza sativa)中成功克隆了OsGLR3.1基因，同时Kang等(2006)在小萝卜(Raphanus sativus)上也克隆了RsGLR基因，但是这些基因的许多功能还是未知的。Kim等(2001)利用转基因方法研究表明AtGLR3.2可能参与稳定钙素的动态平衡，超表达AtGLR3.2的拟南芥植株表现缺钙症状，并对K⁺和Na⁺胁迫超敏感，但供应钙素则可缓解以上症状。Kang等(2003；2004)研究表明AtGLR1.1可以调节C、N代谢和脱落酸的生物合成及信号转导。

平邑甜茶(Malus hupehensis var. pingyiensis)是我国特有的植物种，广泛用作苹果砧木；它具有高度无融合生殖能力，实生苗个体一致性非常好，易于检测处理间的差异(杨洪强等，1997)。本文以平邑甜茶的新根为试材成功克隆了MhGLR3.6全长基因，初步研究了其表达特性，并利用农杆菌介导的方法进行了‘皇家嘎拉’苹果(Malus domestica cv. Royal Gala)的遗传转化，为进一步克隆平邑甜茶中GLRs家族的其他成员以及研究GLRs基因在平邑甜茶生长发育中的作用奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

以平邑甜茶新根为材料。DNA回收纯化试剂盒、pMD18-T载体、Taq酶、T₄-DNA连接酶和限制性内切酶购自大连宝生物公司。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株由本实验室保存。SMART^TM RACE cDNA Amplicating Kit为Clontech公司产品。DNA测序与引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 引物设计和合成

根据已知的拟南芥、水稻和小萝卜中GLRs的氨基酸序列，利用NCBI的tBALSTp程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)查询苹果上GLR的EST序列，设计特异引物用于5′RACE和3′RACE。5′RACE引物GSP1：5′-CACTAAGCGACCAAGGGTGCTGACTGT-3′；3′RACE引物GSP2：5′-CATGATGTGGGGTGTGACG-3′。根据测序拼接结果，设计特异引物P5-1、P5-2和P3-1、P3-2，采用巢式PCR进行MhGLR3.6全长基因克隆。P5-1：5′-AAGTCGGTAGATGCTGGGTTAG-3′；P5-2：5′-ACTTTCTGGGAGGTTGGTTT-3′，P3-1：5′-ACTCATTCGTATCA GAACAGT-3′；P3-2：5′-CCACTTGGAGTTGGATGGT-3′。

1.3 新根总RNA的提取和cDNA第一条链的合成

平邑甜茶新根中总RNA的提取采用CTAB法(Chang et al.，1993)进行，按照SMART^TM RACE cDNA Amplicating Kit的说明书进行cDNA第一条链的合成。

1.4 RACE扩增

PCR的反应体系(50 μL)如表 1所示，Master Mix的成分是34.5 μL PCR-Grade Water；5 μL 10× Advantage 2 PCR Buffer；1 μL dNTP Mix (10 mmol·L^-1)；1 μL 50× Advantage 2 Polymerase Mix。反应程序为touchdown PCR，5个循环：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min；5个循环：94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min；25个循环：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min。测序结果用ContigExpress进行拼接。

1.5 MhGLR3.6全长基因的克隆

PCR反应体系：2.5 mmol·L^-1 dNTP 8 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 5 μL，10× LA PCR缓冲液5 μL，上下游引物各2 μL(约10 pmol·L^-1)。逆转录产物1 μL，LA Taq酶0.5 μL (5 U·μL^-1)，用重蒸水补充至总体积50 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min后，按以下程序进行PCR扩增：94 ℃变性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。采用巢式PCR方式，首先用引物P5-1与P3-1进行反应，将PCR产物稀释40倍后，取1 μL作为模板用引物P5-2和P3-2进行第2次PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆进行测序。

1.6 荧光定量PCR

取平邑甜茶种子，消毒层积后，播于洗净消毒的河砂中。当幼苗第6片真叶刚出现时，将一部分幼苗分根、茎、叶收获，迅速用液氮冷冻后置于-80 ℃保存备用。其余的幼苗分别浇100 μmol·L^-1 L-谷氨酸和50 mg·kg^-1 IBA溶液，处理30 min后取根，迅速用液氮冷冻，置于-80 ℃保存备用。

采用TaqMan探针法进行荧光定量PCR反应，使用Primer Express软件设计引物和探针。引物GF：TCAAATCCTTGGGCTT；GR：AATCATCATTATGCCTGTGG。探针：fma+CCGCCTTCTTTCTCGTTGGAAC+tamra。以r18sRNA作为管家基因。

1.7 MhGLR3.6反义表达载体的构建

以含有MhGLR3.6编码区序列的pMD18-T载体为模板，用引物M13-48和P5-2进行PCR扩增，筛选出含有MhGLR3.6编码区反向插入pMD18-T载体的菌落，采用碱裂解法提取质粒，用XbaⅠ和SalⅠ进行双酶切，反应条件是37 ℃ 3 h，经1%的琼脂糖凝胶电泳，回收MhGLR3.6目的基因。同时，用XbaⅠ和SalⅠ双酶切植物表达载体pBI121，电泳回收载体片断。回收的MhGLR3.6目的基因与pBI121在T4-DNA连接酶的作用下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，通过PCR和双酶切进行鉴定。

1.8 ‘皇家嘎拉’苹果的遗传转化

参照刘庆忠等(2001)的方法进行遗传转化。将构建的植物表达载体pBI121-MhGLR3.6转入农杆菌LBA4404。切割好的外植体于农杆菌中浸蘸，用无菌滤纸吸去多余液体转移到预筛选培养基(MS附加6-BA 4.0 mg·L^-1、IBA 0.4 mg·L^-1、羧苄青霉素250 mg·L^-1)中，黑暗条件下培养3~4 d。然后移入筛选培养基(MS附加6-BA 4.0 mg·L^-1、IBA 0.4 mg·L^-1、羧苄青霉素250 mg·L^-1、卡那霉素20 mg·L^-1)中，在黑暗条件下培养3~4 d后转光照条件下(25 ℃，16 h光照和8 h黑暗)培养6周。期间每隔2周更换1次新鲜选择培养基。选取抗卡那霉素的新梢，在附加20 mg·L^-1卡那霉素的增殖培养基上扩繁。在1/2MS附加IBA 0.1 mg·L^-1的生根培养基上诱导生根。

2 结果与分析 2.1 MhGLR3.6 5′RACE和3′RACE的克隆

以平邑甜茶新根cDNA为模板，采用5′RACE和3′RACE扩增分别得到2 600 bp的5′RACE产物(图 1)和1 200 bp的3′RACE产物(图 2)，分别将其与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒用于测序。测序结果拼接后得到一个3 600 bp大小、编码946个氨基酸的序列，推测分子量为107.809 ku。将该序列的核苷酸与氨基酸序列分别在NCBI服务器的Blast(blastn和blastp)软件进行检索，初步推断所克隆的基因为谷氨酸受体基因。

2.2 MhGLR3.6全长基因的克隆

根据5′RACE和3′RACE的拼接结果设计特异引物P3-1、P5-1、P3-2和P5-2。以P3-1和P5-1的PCR产物为模板，用P3-2和P5-2做巢式PCR扩增获得一个2 900 bp的目的片断(图 3)，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α。测序结果与5′RACE和3′RACE拼接序列的编码区完全相同，说明获得了MhGLR3.6的完整编码区。

2.3 MhGLR3.6基因的序列分析

利用CLUSTAL X ver.1.8软件(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/)将拟南芥AtGLRs、水稻OsGLR3.1与MhGLR3.6的氨基酸序列进行系统进化树分析，发现MhGLR3.6属于拟南芥GLRs家族中的第3亚家族且与AtGLR3.6的同源关系最近(图 4)。

利用ProtComp Version 6.1软件(http://www.softberry.com/berry.phtml)对MhGLR3.6进行亚细胞定位预测，发现MhGLR3.6定位于质膜上。利用TMHMM version 2.0(URL http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对MhGLR3.6进行亲水性分析，结果显示MhGLR3.6包含3个跨膜结构域(M1、M3、M4)，一个N末端信号肽Sp，一个凹膜结构域M2。Sp与M1、M3与M4之间分别为配体结合结构域GlnH1和GlnH2(图 5)。

2.4 荧光定量PCR

采用荧光定量PCR方法分析MhGLR3.6的表达特性。纵坐标mRNA相对含量表示目的基因相对拷贝数/管家基因相对拷贝数。结果显示，MhGLR3.6在平邑甜茶根、茎、叶中均有表达；叶中的表达量最高，根中的表达量最低，仅为叶中表达量的10.5%(图 6)。由图 7可以看出L-谷氨酸和IBA处理能诱导根中MhGLR3.6的表达，mRNA相对含量分别比对照高686.4%和196.4%。

2.5 抗性再生植株的获得

为了确定MhGLR3.6基因的功能，构建了MhGLR3.6的反义表达载体。将MhGLR3.6反向插入植物表达载体pBI121的35 S启动子的下游，采用农杆菌介导法进行‘皇家嘎拉’苹果的遗传转化，在筛选培养基上获得抗性再生植株(图 8)。

3 结论与讨论

自从Lam等(1998)首次从拟南芥中克隆到了植物GLR基因后，关于GLR基因与植物生长发育之间关系的研究变得日益增多，但它们在植物生理活动中的许多作用仍然不清楚。目前已从拟南芥基因组中分离出了20个GLRs基因，可以分为3个蛋白家族，并且都包含动物iGluRs的所有信号结构域(Davenport, 2002)。Lam等(1998)研究表明，植物GLRs参与光信号转导过程。Kim等(2001)研究表明，超表达AtGLR3.2的转基因拟南芥幼苗表现很多形态上的改变，如植株顶部出现坏疽，植株变矮，出现大量二次花序及生长缓慢等。Kang等(2006)采用微阵列分析表明拟南芥植株超表达RsGLR可促进防御基因和茉莉酸(JA)生物合成基因的表达，并可明显抑制灰霉病菌的生长；RsGLR作为质膜中谷氨酸门控的Ca²⁺通道而起作用。Li等(2006)研究认为，OsGLR3.1基因在维持水稻根尖分生组织细胞正常分化、促进细胞存活中发挥重要作用。

本研究中以平邑甜茶新根为材料成功克隆了GLRs的同源基因MhGLR3.6。系统进化树分析显示，MhGLR3.6属于GLRs家族的第三亚家族且与AtGLR3.6的同源关系最近(图 4)。利用TMHMM version 2.0程序对MhGLR3.6进行亲水性分析表明，MhGLR3.6包含有动物iGluRs的6个具有重要功能的保守结构域，与其他植物上GLRs的结构相似。采用荧光定量PCR方法确定MhGLR3.6在平邑甜茶根、茎、叶中均有表达且在叶中的表达量最高(图 6)，L-谷氨酸和IBA能诱导根中MhGLR3.6的表达(图 7)。尽管序列同源性分析和基因表达模式常常作为推测基因功能的重要标准，但是功能分析才能最终说明它在植物发育过程中的作用。为确定MhGLR3.6在苹果中的功能，构建35S::MhGLR3.6反义表达载体，并对‘皇家嘎啦’苹果进行农杆菌介导的遗传转化，期望通过转基因植株的某些特征来推测MhGLR3.6基因的部分功能。