γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在于生物体内的非蛋白质氨基酸(Bown et al., 1997)。动物中，GABA主要作为中枢神经系统的一种抑制性神经递质(Hertz et al., 1983)。植物中GABA首先是Steward等1949年在马铃薯(Solanum tuberosum)中分离得到，谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(GAD)脱羧是其主要合成途径之一(Kathiresan et al., 1997)。GABA在调解植物体内的pH值, 氮的贮存、发育和碳的代谢以及抵御逆境等方面具有重要作用(田小磊等，2002；蒋振晖等，2003)。研究表明，生物胁迫(机械损伤、病虫害) (Bown et al., 2006)和非生物胁迫(缺氧、冷害、盐胁迫、干旱)(Shelp et al., 1999)等逆境均能诱导植物体内GABA含量明显增加。外源施加GABA能够促进低氧胁迫下网纹丝瓜(Cucunris melo var. raticulalus)(高洪波等，2004)和盐胁迫下玉米(Zea mays)(田小磊等，2005)抗氧化酶活性的提高，从而提高耐胁迫的能力。另外，逆境胁迫诱导植物体内迅速积累GABA的同时也促使乙烯的产生，而且GABA的产生要先于乙烯(Bown et al., 2006)。正常生长条件下，外源GABA处理向日葵(Helianthus annuus)12 h即诱导乙烯含量增加14倍，同时促进了乙烯生成关键基因1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶的表达水平明显增加(Kathiresan et al., 1997)。乙烯作为一种重要的胁迫信号激素，在植物抵御外界胁迫时起着非常重要的作用。在盐胁迫条件下施加外源GABA对植物乙烯生成及相关基因表达水平的影响少有报道。

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)是我国西北沙漠和干旱、半干旱地区主要栽培的豆科灌木之一，具有重要经济价值和生态、社会效益。以前的研究中曾发现盐胁迫条件下中间锦鸡儿的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因诱导表达增强，而GAD表达量和活性的增强有利于内源GABA的积累。本文以中间锦鸡儿为试验材料，研究NaCl胁迫条件下外源GABA对其乙烯生成及相关基因表达水平的影响，以期初步探讨外源GABA对NaCl胁迫下木本植物中间锦鸡儿乙烯生成的调控作用，也可以为中间锦鸡儿的抗逆性研究及遗传改良提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

中间锦鸡儿种子采于内蒙古自治区和林县的内蒙古林科院试验基地，土壤类型为沙质。由于采种地为贫瘠的沙漠，因此种子发芽后进行了自来水和营养液2种培养方法比较试验。

1.2 试验方法 1.2.1 试验材料处理

中间锦鸡儿种子用自来水冲洗5次后，进行沙埋发芽处理。2~3 d后，种子胚根突破种皮，伸长到1~2 cm时，挑选胚根长度基本一致的幼苗在连有通气装置的容器中进行水培，每隔2~3 d换水1次。正常培养6周后，开始进行NaCl胁迫和外源GABA处理。通过不同浓度外源GABA对200 mmol·L^-1NaCl胁迫72 h时的试验确定不同浓度处理效果；采用250 mmol·L^-1 NaCl胁迫，研究在10 mmol·L^-1外源GABA条件下不同处理时间时乙烯生成及相关基因的动态变化。具体处理方法如下。处理一:200 mmol·L^-1 NaCl和200 mmol·L^-1 NaCl溶液中分别施加不同浓度的外源GABA(0、1.0、2.5、5.0和10 mmol·L^-1)处理72 h；处理二：250 mmol·L^-1 NaCl和250 mmol·L^-1 NaCl+10 mmol·L^-1 GABA分别处理0、12、24、48和72 h。以无NaCl和外源GABA处理的幼苗为对照。

1.2.2 含水量测定

采用烘干法测定不同处理时叶片的含水量。取上述处理茎叶立即测定叶片的鲜质量(V_f)，然后叶片烘干并称重(V_d)，每个样品重复3次。含水量(%)＝(V_f－V_d)/V_f×100%。

1.2.3 乙烯测定

植物离体的伤害能够诱发乙烯的生成，因此为了尽可能减少伤害胁迫诱发乙烯的生成，参照Kathiresan等(1997)和前期预试验的结果，本研究中间锦鸡儿地上部分和根部的乙烯释放时间控制在2 h；同时，为了能够分别测定地上部分和根部乙烯含量的变化，取幼苗第一轮叶以上部分(茎叶)为地上部分，茎基部以下2 cm到根尖部分为根部分别放到5 mL容积的青霉素瓶中，每组2~3株，每个处理重复3次，暗处放置2 h后，微量进样器吸取1 mL样品用于乙烯测定。

气相色谱条件：应用日立-163型气相色谱测定(北京林业大学生物中心)，填充柱为GDX102(柱长3 m，内径3 mm)，氢离子火焰检测器(FID)。检测器温度为150 ℃，进样口温度60 ℃，柱温60 ℃。

1.2.4 乙烯生成相关基因CaACO的RT-PCR分析

采用Trizol试剂(Invitrogen)提取处理两幼苗的根部总RNA，紫外分光光度计检测质量和测定浓度。每个处理样品取等量的总RNA作为模板，以PowerScriptTM Reverse Transcriptase(Clontech)合成第一链cDNA。根据已有的中间锦鸡儿ACC氧化酶基因CaACO1和CaACO2的特异性片断设计上、下游引物：

CaACO1-F：5-CCCAAGTAATTACCGTTATGGAGACT-3；

CaACO1-R：5-AGGACCCTTGTCACCGAACTTA-3；

CaACO2-F：5-ACAGATGCGGGTGGCATAAT-3；

CaACO2-R：5-CCATTGCTCAACACTTCAACTTG-3。

CaACO1和CaACO2分别在PE9600上扩增25和28个循环；以ACTIN为内参照物，扩增29个循环；上述PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测并照相。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excell进行数据处理，SPSS统计软件进行方差分析。

2 结果与分析 2.1 NaCl胁迫时不同浓度外源GABA对含水量的影响

中间锦鸡儿处于200mmol·L^-1 NaCl胁迫72 h，其地上部分含水量与对照相比没有明显变化，其原因一方面是200mmol·L^-1 NaCl对幼苗产生较轻的胁迫；另一方面由于地上部分包含已木质化的茎部，从而减弱了叶片失水对含水量的影响。在相同NaCl胁迫条件下施加不同浓度外源GABA时，与200mmol·L^-1 NaCl处理相比含水量明显增加(图 1)。外源GABA为2.5mmol·L^-1时，含水量比200 mmol·L^-1 NaCl胁迫时提高了44.1%，方差分析表明外源GABA的作用达到显著差异(P < 0.05)；而后，随着GABA浓度的增大，含水量的增加幅度降低，但10mmol·L^-1时含水量仍比200 mmol·L^-1 NaCl胁迫时提高了11.8%。

从以上结果可以看出，当中间锦鸡儿幼苗处于NaCl胁迫条件下，通过外施GABA可以提高茎叶部分的含水量，从而缓解NaCl胁迫对植物的伤害。

2.2 NaCl胁迫时不同浓度外源GABA对乙烯生成的影响

200mmol·L^-1 NaCl胁迫72 h，中间锦鸡儿茎叶和根部乙烯含量分别比对照增加了424.4%和40.8%(图 2A，B)。方差分析表明:NaCl胁迫72 h时，茎叶部分乙烯增加明显(P < 0.05)，而根部差异不显著(P>0.05)。随着外源GABA浓度的增加，NaCl胁迫条件下中间锦鸡儿体内的乙烯含量也增加, 当GABA浓度增加到10mmol·L^-1时，茎叶和根部的乙烯含量分别比NaCl胁迫条件下增加了95.3%和156.7%。方差分析表明:NaCl胁迫条件下，外源GABA浓度达到10mmol·L^-1时对乙烯生成的促进作用差异显著(P < 0.05)。NaCl胁迫条件下较高浓度的外源GABA明显促进了中间锦鸡儿体内乙烯的生成，并且根部受到的影响大于地上部分。

2.3 NaCl胁迫不同时间外源GABA对乙烯生成的影响

中间锦鸡儿幼苗处于250 mmol·L^-1 NaCl胁迫条件时，随着处理时间的延长体内乙烯含量呈现先明显增加然后又急剧降低的趋势(图 3A，B)。当NaCl胁迫24 h时，茎叶和根部乙烯含量均增加到最大值，分别比对照提高了282.7%和341.8%。方差分析表明：NaCl胁迫24 h时，茎叶和根部的增加幅度达到极显著差异(P < 0.01)；然后随着NaCl处理时间的延长，乙烯的含量降低到低于对照水平。然而，施加10mmol·L^-1外源GABA初期，乙烯含量增加的幅度受到明显的抑制(图 3A，B)；胁迫24 h时，茎叶和根部乙烯含量分别比对照提高了30.5%和40.1%(P < 0.05)，而此时乙烯的含量却明显低于同期NaCl处理的水平(P < 0.01)。随着处理时间的延长，GABA处理胁迫72 h时，茎叶和根部乙烯含量分别比NaCl胁迫时乙烯含量增加了27.6%和94.1%。随着处理时间的延长外源GABA延缓了NaCl胁迫条件下乙烯含量的降低，并且方差分析表明在根部中的调控作用达到显著差异(P < 0.05)。

2.4 乙烯生成相关基因CaACO的表达模式

NaCl胁迫条件下，通过施加外源GABA明显提高了中间锦鸡儿地上部分和根部乙烯的生成，并且根部受到的促进作用明显高于地上部分(图 2A，B；图 3A，B)。以根部为研究对象，初步探讨了外源GABA对NaCl胁迫下乙烯生成关键基因CaACO1和CaACO2的表达模式的影响(图 4)。250 mmol·L^-1 NaCl处理12 h时，CaACO1和CaACO2在mRNA水平达到最大水平；然后，随着处理时间的延长，二者的表达水平均明显降低。然而，外施10 mmol·L^-1 GABA处理12 h和24 h时明显诱导了CaACO1和CaACO2在mRNA水平的表达；随着处理时间的延长，尽管外施10 mmol·L^-1 GABA的作用效果减弱，但仍持续到处理72 h(图 4)。并且，从图 4也可明显看出在2种处理条件下，CaACO2比CaACO1具有较高的表达水平，原因可能是外源GABA对这2个基因的调控有所差别。

3 结论与讨论

干旱、高盐、冷害和缺氧等非生物胁迫逆境能够诱导植物体内源GABA含量明显增加(Shelp et al., 1999)；反之，通过外源施加GABA能够提高丝瓜和玉米体内抗氧化酶的活性(高洪波等，2004；田小磊等，2005)，提高植物的抗逆能力；另外，外源GABA也能够诱导正常生长条件下向日葵体内乙烯含量的大量增加(Kathiresan et al., 1997)，而乙烯作为植物体内重要的信号分子，在植物适应环境胁迫方面起着重要作用(Guo et al., 2003)。

本研究表明:NaCl胁迫诱导了中间锦鸡儿体内乙烯含量的增加，但是外源GABA能够进一步提高NaCl胁迫条件下中间锦鸡儿体内乙烯含量；研究也发现, 在250 mmol·L^-1 NaCl胁迫初期(24 h)，NaCl胁迫对乙烯含量的增加起主导作用，外源GABA反而抑制了乙烯含量的增加；随着胁迫时间的延长，外源GABA对乙烯的生成表现为促进作用。外源GABA处理能够提高植物体内腐胺、亚精胺和精胺等多胺含量，降低乙烯的含量(Turano et al. 1997)，而胁迫条件下乙烯和多胺(亚精胺和精胺)的合成需要共同的前体S-腺苷蛋氨酸(SAM)(王晓云等，2002)。植物在生长发育过程中和受到外界胁迫刺激时能够通过积累多胺抑制乙烯的生成，从而延缓其衰老(王晓云等，2002)。乙烯生成抑制剂1-甲基环丙烯(MCP)处理苹果(Malus)初期多胺和乙烯之间可能存在着相互拮抗作用，而后逐渐消失(Pang et al., 2006)。本研究发现：在NaCl胁迫初期外源GABA抑制了中间锦鸡儿乙烯的生成，可能是外源GABA迅速诱导了内源多胺的积累(Turano et al. 1997)，因此与单一NaCl胁迫下相比，乙烯的生成减少；而随着处理时间的延长，多胺的抑制效果减弱，外源GABA对乙烯生成的影响占了主导作用。乙烯通过SAM经过ACC合成酶和ACC氧化酶(ACO)两步关键催化反应生成。转录水平研究进一步表明，NaCl胁迫初期(12 h和24 h)外源GABA确实在mRNA水平提高了中间锦鸡儿根部CaACO1和CaACO2的表达水平。此时乙烯的含量却受到明显的抑制，这可能说明乙烯的生成在转录后水平受到了抑制，即在ACO翻译成ACC氧化酶的过程中受到了调控。大豆叶片中发现外源GABA促进了多胺的合成，而乙烯的含量降低(Turano et al. 1997)，推测其原因是多胺的积累消耗了过多的SAM，因而影响了乙烯生成前体的需求。

本研究发现：NaCl胁迫条件下外源GABA能够调控中间锦鸡儿幼苗乙烯生成及生成相关基因ACO在mRNA水平的表达；盐胁迫初期外源GABA对乙烯含量和转录水平CaACO1和CaACO2调控表面看来存在着矛盾，原因可能是受到转录后水平调控，调节mRNA水平的ACO翻译为蛋白质ACO的速率。另外，GABA对乙烯的释放在24 h有抑制作用，而后期却有促进作用，说明GABA和乙烯不是简单的因果关系，还和其他方面的因素有关。越来越多的研究表明：GABA可能作为一种信号分子在植物生长发育和抵御逆境中起着重要作用(Bouche et al., 2004)。此处GABA是否对乙烯的生成起到信号调控的作用，今后将开展模式植物拟南芥(Arabidopsis)和中间锦鸡儿的比较研究，以期进一步探讨外源GABA在生理和分子水平上对乙烯生成的调控机制。