林业科学  2008, Vol. 44 Issue (8): 149-151   PDF    
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温鲁, 翁梁, 朱明伟, 刘森琴.
Wen Lu, Weng Liang, Zhu Mingwei, Liu Senqin
不同林区蛹虫草活性成分含量的比较
Content Comparison of Active Constituent in Cordyceps militaris from Different Forest Regions
林业科学, 2008, 44(8): 149-151.
Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(8): 149-151.

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收稿日期:2007-06-22

作者相关文章

温鲁
翁梁
朱明伟
刘森琴

不同林区蛹虫草活性成分含量的比较
温鲁, 翁梁, 朱明伟, 刘森琴     
淮阴师范学院资源微生物研究所 淮安 223300
关键词:林区    蛹虫草    虫草素    腺苷    虫草酸    虫草多糖    
Content Comparison of Active Constituent in Cordyceps militaris from Different Forest Regions
Wen Lu, Weng Liang, Zhu Mingwei, Liu Senqin     
Institute of Resource Microorganism, Huaiyin Teachers College Huai'an 223300
Abstract: To compare the content of main active constituent in cordyceps from different forest region in China. The active constituent in the cordyceps was withdrawed by microwave method, the cordycepin and adenosine content were measured by HPLC, the cordyceps acid was measured by periodic acid sodium colorimetry method, thepolysaccharides was measured by phenol-sulphuric acid method. Cordyceps militaris's cordycepin content was higher than 20 mg·g-1 in cordyceps from two forest regions in Jiangsu Province, cordyceps acid content was the highest, and was 49.38 mg·g-1 in C. militaris from Mountain Funiu forest region in Henan Province; the total quantity of four kinds of active constituent in C. militaris from two Jiangsu forest regions were the highest, surpassed 100 mg·g-1. The results showed that the main active constituent content in C. militaris from different forest region was largely different, the active constituent content in C. militaris from two Jiangsu forest regions was relative higher than others.
Key words: forest regions    Cordyceps militaris    cordycepin    adenosine    cordyceps acid    polysaccharide    

蛹虫草(Cordyceps militaris),别名蛹草、北虫草、北冬虫夏草,是著名药材冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的近缘种,也是虫草属真菌的模式种,具有和冬虫夏草类似的活性成分和医疗保健功效(梁宗琦,2007)。冬虫夏草生境特殊,需生长在青海、四川、西藏等海拔3 000~5 000 m的高寒地区,蛹虫草则不需要严格的生态环境,我国湖北、河北、吉林、陕西、安徽、江苏、江西、河南、云南、广西、贵州、四川、台湾等省区均有发现。蛹虫草常发生在次生林地带的阔叶林及混杂林下,要求林间郁闭度在0.6左右,土质疏松,含水量70%~80%,一般以鳞翅目昆虫的蛹或幼虫为寄主,其次为鞘翅目和双翅目昆虫的幼虫与蛹,6—9月从地面长出子座,对林区害虫的自然控制起着重要作用(梁宗琦,2007蒲蛰龙等,1996)。蛹虫草寄主面较广、寄生性较强,如深入研究,有望制成防治森林害虫的新型生物制剂。

到目前为止,对蛹虫草进行的研究,主要还是其活性成分和医疗保健功效,这也是目前开发利用的重点。冬虫夏草由于生境特殊、寄主单一,难以进行人工培育,加之滥采滥挖,导致资源破坏,产量锐减,使市场价格暴涨;蛹虫草则具有不苛求生境和寄主、已可人工培育及活性成分含量不亚于冬虫夏草等优点,使之成为冬虫夏草代用品的首选。蛹虫草的活性成分主要有虫草酸、虫草多糖、腺苷和虫草素等,特别是虫草素的含量远高于冬虫夏草(韦会平等,2004)。但不同林区的蛹虫草在活性成分含量上有无不同,还未见研究比较。笔者对来自河南伏牛山、江西井冈山、苏南紫金山和苏北老子山林区的4株蛹虫草进行检测比较,现将研究情况报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

1) 样品   A来自河南伏牛山,由河南大学生物工程研究所刘德育研究员提供;B来自江西井冈山,由江西农科院农业应用微生物研究所张诚副研究员提供;C来自江苏南京紫金山,由江苏省农科院食用菌研究开发中心蒋宁助理研究员提供;D来自江苏盱眙老子山,由淮阴师范学院资源微生物研究所自行采集。以上菌株经转接活化,用相同培养基在同一条件下进行固体培养,取培养物于60 ℃烘干粉碎,然后进行各项检测。

2) 试剂  虫草素和腺苷标准品由上海化学试剂公司进口分装,磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、四氢呋喃、氯化钠,D-甘露醇、鼠李糖、高碘酸钠、乙酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、盐酸,葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸等,均为国产分析纯试剂,试验用水为二次蒸馏水。

3) 设备  培养设备:高压灭菌器,洁净工作台,恒温培养箱等;样品处理设备:电热恒温鼓风干燥箱,多功能食品加工机,电子天平,微波炉,台式离心机,水浴锅等;检测设备:Waters 600E高效液相色谱系统,Waters 2487紫外检测器,Empower色谱数据管理系统,721S分光光度计等。其余玻璃器材为实验室常规仪器。

1.2 方法

1) 活性成分提取  采用微波提取法(夏敏等,2006)。用100 mL试剂瓶,加入精确称量的样品和准确量度的提取液,每6瓶1组,不够6瓶时用盛有同量自来水的试剂瓶补充,在家用微波炉中排成一圈,用适当火力的微波进行提取。不同活性成分的提取火力和时间,需用试验确定,以获得最佳提取效果。提取后用离心机离心,取上清液进行后续步骤的操作。

2) 虫草素和腺苷测定  采用高效液相色谱法(夏敏等,2007)。色谱柱为Waters NOVA-PAK C18反相柱,3.9 mm×300 mm,4 μm;流动相为KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH=6.86,0.01 mol·L-1)+1%四氢呋喃,流速1.0 mL·min-1;检测波长260 nm。虫草素标准曲线的回归方程为Y=3.10×106X-1.34×104R2=0.999 9;腺苷标准曲线的回归方程为Y=3.55×106X-5.72×103R2=0.999 9。式中Y为色谱峰面积,X为虫草素或腺苷的进样量(μg)。

样品提取时,向100 mL试剂瓶中加入0.250 0 g样品,再加25.00 mL生理盐水提取液,用中火(P50)处理2.0 min,将提取液离心,上清液用0.2 μm水系针头滤器压滤,压滤液进行高效液相色谱检测。

3) 虫草酸测定  采用高碘酸钠比色法(温鲁等,2004)。虫草酸的化学成分为D-甘露醇,准确称取甘露醇标准品0.500 0 g,配成5 mg·mL-1的甘露醇标准溶液,再稀释成不同质量浓度的系列标准溶液;用微量取样器分别取不同质量浓度的标准溶液300 μL,加700 μL蒸馏水,然后加1.00 mL高碘酸钠试液,混匀,室温放置10 min,加2 mL 0.1%鼠李糖,再加4 mL新配制的Nash试剂(用冰醋酸和乙酰丙酮等配制),53 ℃水浴15 min,用分光光度计在420 nm处测吸光度,得甘露醇含量C与吸光度A的回归方程:C=0.396 2A-0.004 8,R2=0.999 9。

样品提取时,称取0.100 0 g样品放入试剂瓶,加入25.00 mL蒸馏水,以中火(P 50)处理1 min,离心后取上清液300 μL,其余操作与标准溶液测定步骤相同。测得吸光度后,按回归方程计算提取液的虫草酸含量,则样品中的虫草酸含量(mg·g-1)= C×25/m,式中C为样品溶液中虫草酸含量(mg·mL-1),25是样品提取液体积(mL), m为称取样品的质量(g)。

4) 虫草多糖测定  采用苯酚-硫酸法(来永斌等,2001)。多糖在酸性条件下水解成葡萄糖等单糖,以葡萄糖为标样配制系列标准溶液,分别取各质量浓度标准溶液1.00 mL,加入5%苯酚溶液1.5 mL,浓H2SO4 7.5 mL,常温显色30 min,于490 nm处测定吸光度,得葡萄糖含量C与吸光度A的回归方程:C=0.153 1 A-0.002 4,R2=0.999 1。

样品提取时,称取0.500 0 g样品放入试剂瓶,加入20.00 mL蒸馏水,以中火(P 50)处理3.5 min,离心后取上清液5.00 mL,加20 mL无水乙醇,待多糖沉降,离心去上清液,将沉淀晾干,加热水溶解,定容至10 mL,从中取0.10 mL,用水补足1.00 mL,其余操作与标准溶液测定步骤相同。样品中多糖含量(mg·g-1)= C×100×4/m,式中C为0.10 mL测试液中多糖含量(mg),100是多糖测试液总体积10 mL与0.10 mL取出液的体积比,4为微波提取液总体积20 mL与醇沉时取出液5 mL的体积比,m为称取样品的质量(g)。

2 结果和分析 2.1 结果

测定结果见表 1,表中数据为平均值(n=5),各项测定的相对标准偏差(RSD)分别在1.04%~1.92%之间。

表 1 不同林区蛹虫草主要活性成分含量 Tab.1 Different forest Cordyceps militaris main active constituent content     mg·mL-1
2.2 分析

1) 从上表可以看出,来自不同林区的蛹虫草,主要活性成分虫草素的含量存在较大差异,含量最低的是井冈山林区的菌株,其次为伏牛山林区的菌株;江苏紫金山和老子山2个林区菌株的虫草素含量均很高,最高的紫金山菌株是井冈山菌株的3.14倍。虫草素是蛹虫草最重要的活性成分(梁宗琦,2007刘东泽,2004),其含量高低在很大程度上影响着蛹虫草的医疗保健功效。腺苷含量则以紫金山菌株最低,用高效液相色谱未能检出,而井冈山菌株的腺苷含量最高。

2) 虫草酸含量以伏牛山菌株最高,井冈山菌株最低,前者是后者的1.65倍;江苏2个菌株相近,均处于较高水平。虫草多糖则以伏牛山菌株最低,江苏老子山菌株最高,紫金山菌株与老子山菌株基本一致,井冈山菌株也很高。

3) 综合4种主要活性成分总量,江苏2个菌株仍然相近并处于最高水平,伏牛山菌株次之,井冈山菌株最低。

3 小结与讨论

1) 来自不同林区蛹虫草的活性成分含量,存在较为明显的差距,这里既有菌株之间的差异,也有林区条件(如林木种类和郁闭度、昆虫种类和习性、土壤质地和酸碱度、气温和降水量等)不同所产生的影响。江苏2个林区自然条件相近,所以2个菌株的活性成分含量很接近,而且均处于很高水平。

2) 本研究仅对不同林区蛹虫草菌株的固体培养物进行了检测比较,未检测自然采集的野生蛹虫草和代料栽培的人工蛹虫草。据研究,蛹虫草固体培养物的活性成分含量,较野生蛹虫草和人工蛹虫草高得多(温鲁等,2008),而且含量高低同样体现出野生蛹虫草和人工蛹虫草的差异。

3) 受菌种来源制约,对国内其他林区的蛹虫草未能进行检测比较,今后将创造条件,扩大检测比较的范围。

4) 不同林区蛹虫草的活性成分含量和对昆虫的寄生能力之间,是否有某种相关性,如果有,可否通过改变活性成分含量来提高蛹虫草对林区害虫的防治能力,是一个值得研究的新问题。

参考文献(References)
来永斌, 王琦, 孙月. 2001. 蛹虫草多糖含量的测定与分析. 中成药, 23(7): 517-518. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2001.07.020
梁宗琦. 2007. 中国真菌志:第32卷虫草属. 北京: 科学出版社, 2-3.
刘东泽, 陈伟, 高新华, 等. 2004. 虫草菌素(3'-脱氧腺苷)研究进展. 上海农业学报, 20(2): 89-93. DOI:10.3969/j.issn.1000-3924.2004.02.023
蒲蛰龙, 李增智. 1996. 昆虫真菌学. 合肥: 安徽科学技术出版社, 228-231.
韦会平, 肖波, 胡开治. 2004. 蛹虫草药用价值考. 中药材, 27(3): 215-217. DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2004.03.031
温鲁, 尹起范, 唐玉玲, 等. 2004. 蚕虫草与有关虫草活性成分检测比较. 食品科学, 25(8): 155-157. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.08.036
温鲁, 翁梁, 朱明伟, 等. 2008. 蛹虫草新型菌粉活性成分含量的测定. 江苏农业学报, 24(2): 219-220. DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2008.02.023
夏敏, 温鲁. 2006. 微波法提取虫草素研究. 食品科学, 27(10): 248-251. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.10.057
夏敏, 尹起范, 温鲁, 等. 2007. 高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素. 理化检验-化学分册, 43(5): 386-388. DOI:10.3321/j.issn:1001-4020.2007.05.016