近年来，随着植物抗虫基因工程的研究及其快速发展，转基因植物的合理利用问题受到了广泛关注。目前，在杨树抗虫基因工程育种方面国内外已经做了大量工作，人们构建、改建了多种基因并将其成功转入杨树(苏晓华等，2003；王敏杰等，2002；王学聘等，1997；郭同斌等，2004；田颖川等，2000；Zhang et al., 2005；Van Frankenhuyzen et al., 2004；Balestrazzi et al., 2006)。其中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)抗虫基因的研究最多，发展也最快。根据其编码的杀虫蛋白的杀虫特性，可将其粗分为6大类(李海涛等，2004)。目前，在杨树抗虫基因工程中应用最多的是抗鳞翅目害虫的Btcry1和抗鞘翅目害虫的Btcry3类基因，转不同类型抗虫基因杨树对靶标害虫均表现出一定的抗虫性。为了深入了解转抗虫基因植物的抗虫选择性, 为转抗虫基因植物的合理利用提供依据，本文对转不同类型Bt抗虫基因741杨的抗虫性进行了研究。

1 材料与方法 1.1 材料

参试的株系为转BtCry3A基因741杨的7个株系和转双抗虫基因(BtCrylAc+API) 741杨的2个株系PB29和PB17。以苗圃中生长的转基因741杨各株系和未转基因741杨1年生植株为试验材料。

测试昆虫为人工饲养的鞘翅目叶甲科的柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)和鳞翅目舟蛾科的杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)。

1.2 方法 1.2.1 转基因741杨外源基因的分子生物学检测

杨树DNA的制备采用CTAB法(王关林等，2002)。采用PCR方法检测外源基因。BtCrylAc基因引物序列：5′CTG ACG TAA GGA TGA CGC AC3′，5′ACT ATT GAT AGT CGC GGC ATC3′。PCR扩增程序：94℃ 50 s, 55℃ 60 s, 72℃ 100 s, 共30个循环。BtCry3A基因引物序列：5′ACC GTC TCT GGT AAG CTC GGT CTT3′，5′TGG CCA AGC GAG GAC CCC TGG AAG 3′。PCR扩增程序：94 ℃、50 s, 52℃、60 s, 72℃、60 s, 共30个循环。反应结束后扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.2 转抗虫基因741杨Bt毒蛋白的检测

采用ELISA法测定。操作步骤按美国Agdia公司生产的BtCrylAb/CrylAc和BtCry3A ELISA平板试剂盒说明进行。测定转BtCry3A基因741杨和转双抗虫基因(BtCrylAc+API) 741杨不同株系毒蛋白含量，以未转基因741杨为对照，计算相对含量。

1.2.3 转基因741杨抗虫性检测

1) 柳蓝叶甲  由室外捕捉柳蓝叶甲成虫于室内用普通741杨叶片在瓶中饲养，待成虫产卵于叶片表面，将卵块用剪刀剪下，放到培养皿(培养皿内壁上贴有潮湿的滤纸)中孵化。大约3~4 d卵孵化为幼虫，将幼虫分装到放有转抗虫基因杨树叶片的培养皿中进行虫试。每个培养皿中饲养20~30头幼虫，每个株系设3个重复，每天记录死亡个数。计算每天的累计死亡率。2)杨扇舟蛾  待杨扇舟蛾卵块孵化后，随机地从中挑选幼虫，用毛笔轻移到清洁干净的高为12 cm、直径8.5 cm的罐头瓶中，每瓶10头左右，4次重复，放入新鲜的转抗虫基因(BtCry3A) 741杨当年生叶片，然后用带通气孔塑料薄膜扎紧瓶口。每2 d换一次新鲜叶片，记录幼虫的死亡情况。总死亡率=饲养末期的死亡总数/初期的饲养总数×100%。

2 结果与分析 2.1 不同外源Bt基因的PCR扩增

将转抗虫基因(BtCry1Ac+API基因)741杨的2个株系和转抗虫基因(BtCry3A)741杨的6个株系和分别提取叶片基因组总DNA，分别以质粒pBtiA和pBCC3作为阳性对照，未转基因植株作为阳性对照，用BtCry1Ac和BtCry3A基因序列设计引物，进行PCR扩增。扩增结果如图 1、2所示。

由图 1、2可以看出，转BtCry1Ac+API基因741杨的2个株系经PCR扩增后，作为阳性对照的pBtiA扩增出1条750 bp的片段，转基因的各株系经PCR扩增后，均得到了1条与预期长度同样大小的750 bp的片段，而未转基因植株未出现PCR扩增特异条带。同时，转抗虫基因(BtCry3A)741杨各株系经PCR扩增后，作为阳性对照的pBCC3扩增出1条612 bp的片段，转基因的各株系经PCR扩增后，均得到了1条与预期长度同样大小的612 bp的片段，未转基因植株没有出现PCR扩增片段。电泳分析结果表明，2种Bt抗虫基因分别在转基因741杨不同株系中稳定存在。

2.2 不同外源Bt基因毒蛋白检测

利用美国Agdia公司生产的BtCrylAb/CrylAc和BtCry3A ELISA平板试剂盒，分别测定转不同Bt基因741杨叶片中Bt毒蛋白含量，结果见图 3、4。

从图 3可见，2个参试的转(BtCry1Ac+API)基因株系中，BtCry1型的毒蛋白含量分别为0.012 7%和0.009 9%。高抗虫性株系pb29的毒蛋白含量高于中等抗虫性的株系pb17。图 4结果表明：5个转BtCry3A基因的株系中，BtCry3型毒蛋白含量为0.067 8%~0.152 1%, 不同株系间存在一定差异，CC71含量相对较高，而CC70含量较低。2种Bt毒蛋白含量比较分析可知，BtCry3型的毒蛋白表达量非常高，是BtCry1型的10倍。

2.3 转不同外源Bt基因株系对不同害虫的抗虫选择性 2.3.1 转BtCry1Ac+API基因株系对不同害虫的抗虫选择性

转BtCry1Ac+API基因741杨对鳞翅目害虫的抗虫效果已有很多报道。转BtCry1Ac+API基因株系pb29对杨扇舟蛾、舞毒蛾(Lymantria dispar)、美国白蛾(Hyphantria cunea)等鳞翅目食叶害虫具有高抗虫性，幼虫死亡率均在80%以上，并且还能抑制存活下来的昆虫幼虫的发育，使其发育速率减缓，不能正常结茧，连续4年饲虫试验未发现其抗虫性有规律下降的趋势。Pb17具有中等抗虫性，对杨扇舟蛾等鳞翅目幼虫致死率50%~80%(Yang et al., 2003；杨敏生等，2005)。

用这2个株系饲养鞘翅目害虫柳兰叶甲幼虫，结果列于图 5。随着饲养时间的延长，幼虫的死亡率增加，饲养到第4天时，幼虫死亡率达到28.4%~42.8%，但转基因株系与未转基因的对照没有明显差异，且各株系幼虫死亡率的变异幅度均较大。表明人工饲养柳兰叶甲幼虫，其敏感性较高，自然死亡率较高，但试验结果未表现出Bt毒蛋白的抗虫效果。

2.3.2 转BtCry3A基因株系对不同害虫的抗虫选择性

用不同株系转抗虫基因(BtCry3A)741杨叶片饲养鞘翅目害虫柳兰叶甲幼虫，以未转基因741杨作对照，结果如表 1。

由表 1可以看出，转基因的不同株系对柳蓝叶甲幼虫的致死作用均很强，部分株系饲养的柳蓝叶甲幼虫在第1天的死亡率就为100%，第1天的死亡率未达到100%的第2天均达到100%。所以不同株系间的致死效应均很强，而不同株系对柳蓝叶甲幼虫的死亡率影响不是很大，均在1~2 d之内死亡率达到100%。由此可见，各转基因株系对柳蓝叶甲幼虫均属于高抗性的，死亡率在2 d之内均可达到100%。

为研究Bt毒蛋白在不同温度环境下的表达情况，设置了4个环境温度进行饲虫试验。从表 1结果可以看出，在22℃条件下，幼虫的死亡速率比较缓慢，除了2个株系外，大部分株系需要2 d才能将柳兰叶甲幼虫全部杀死。随着环境温度的提高，到35℃时，所有株系均在1 d内将幼虫杀死，说明在一定温度范围内，高温有利于Bt毒蛋白的表达。

用不同株系的转抗虫基因(BtCry3A)741杨叶片饲养杨扇舟蛾幼虫14 d，以未转基因741杨作对照，观察结果表明：不同株系转抗虫基因(BtCry3A)741杨对杨扇舟蛾幼虫死亡率有不同的影响。从表 2可以看出：用未转基因741杨叶片喂养的幼虫死亡率居中，死亡率24.73%；转抗虫基因741杨CC84，CC70，CC11，CC31饲养幼虫的死亡率比对照741杨低，死亡率为3.92%~11.01%；CC71饲养幼虫的死亡率与对照差异较小，死亡率为24.06%；CC53饲养幼虫的死亡率比普通741杨的要高，死亡率为42.86%；用CC22的叶片饲养杨扇舟蛾幼虫，死亡率为0。由此表明，转抗虫基因(BtCry3A)741杨各株系对鳞翅目害虫杨扇舟蛾没有明显抗性，仅CC53的死亡率略高于未转抗虫基因的741杨。由于限于条件每个重复饲养的昆虫数量少，不同重复之间幼虫死亡率差异较大，经方差分析不同株系之间未达到显著差异。

3 结论与讨论

自从1981年第1个杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序以来，至今已克隆了几百个杀虫晶体蛋白基因。根据杀虫晶体蛋白的大小及基因特点，主要分为Cry和Cyt两大类。目前广泛应用的主要为Cry类杀虫晶体蛋白。Hofte等(1989)根据杀虫蛋白质氨基酸序列的相似性和杀虫活性，将其分成数个类型，分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等来命名。不同类型Cry晶体蛋白具有不同杀虫选择性，Cry为鳞翅目特异性，CryⅡ为鳞翅目和双翅目特异性，CryⅢ为鞘翅目特异性，CryⅣ为双翅目特异性。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为A、B、C等不同的基因型。

许多报道证明转不同类型Bt基因表现出专一抗虫性特征，如转BtCry1的转基因杨树对杨扇舟蛾、舞毒蛾等害虫表达出抗虫效果，而转BtCry3基因杨树对叶甲等鞘翅目害虫具抗虫性，但对其他害虫的试验结果未见报道。为了检测转入植物体中的BtCry1和BtCry3基因对昆虫抗虫性的选择性，本试验用转双抗虫基因(BtCry1Ac+API)741杨饲养柳蓝叶甲幼虫；用转抗虫基因(BtCry3A)741杨饲养鳞翅目昆虫杨扇舟蛾幼虫，结果表明：转双抗虫基因(BtCry1Ac+API)741杨对柳蓝叶甲幼虫的成活没有任何影响，柳蓝叶甲幼虫能完整地完成1个世代，即由幼虫发育为成虫。转抗虫基因(BtCry3A)741杨对杨扇舟蛾幼虫，同一个试验过程中，饲养的杨扇舟蛾幼虫的死亡率与用普通741杨饲养的幼虫死亡率相差不大，其中有些株系比对照的死亡率还要小。而经过数年试验证明的转双抗虫基因741杨对杨扇舟蛾表现高致死性(Yang，2003；杨敏生等，2005)。试验结果进一步证明了bt毒蛋白的专一抗虫性特征，而对非靶标昆虫没有毒杀作用。

转Bt基因对非目标昆虫、土壤微生物、哺乳动物及人类等影响的研究方面，己取得阶段性成果(苏晓华等，2003)。转不同抗虫基因的杨树对昆虫具有一定的选择性，对非靶标昆虫没有毒害作用，这从一方面说明转Bt基因树木具有杀虫谱窄，针对性强的特点，从另一方面也说明其安全性是比较高的，不会对非靶标害虫及其他生物造成危害。鉴于转Bt树木的杀虫特点，建议在生产中应用时，应根据当地虫害特点选择使用不同类型的转基因树木，既在鞘翅目昆虫为害严重的地区栽种转BtCry1基因高抗鞘翅目害虫的树木，而在鳞翅目昆虫为害严重的地区栽种大量转Btcry3基因高抗鳞翅目害虫的树木。为了扩大杀虫谱，提高抗虫效果，将转不同类型Bt基因树木混合栽种，或者将不同类型Bt基因构件在一个表达载体上，通过基因转化，获得转多Bt基因树木，在生产上栽植应用，通过多种抗虫基因抗性互补，可大大提高转基因树木的抗虫能力，这应该是在今后重点研究的方向。