21世纪是环保的世纪，以高效、低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药以其资源丰富、不破坏生态环境、对环境安全、残留少、选择性强、不杀伤害虫天敌等优点越来越受到人们的青睐(张斌，2002；柴承佑等，2002；刘俊华，2002)。而从植物中寻找杀虫活性物质的研究也为新农药创制提供新的活性先导化合物，对其进一步模拟修饰合成发现结构全新、机理独特、安全高效的农药新品种有着重要的意义，也是研制新农药的主要途径之一。

地肤(Kochia scoparia)，俗名扫帚菜、扫帚苗，属藜科地肤属1年生草本植物，是我国的传统野菜，也是一种传统的中药材，其籽入药，可治赤白痢，泄泻，热淋，目赤，雀盲，皮肤内热赤肿(曹瑞玲等，2003)。地肤提取物有很好的杀螨活性(侯辉等，2004)，曹挥等(2007)研究了地肤全株氯仿提取物对山楂叶螨(Tetranychus viennensis)体内几种酶活性的影响，发现处理后螨体内谷胱甘肽-S-转移酶和羧酸酯酶被激活，单胺氧化酶、Ca²⁺-ATP酶活力受到一定程度的抑制。而地肤主要以其籽入药，因此笔者以地肤子为材料，对其活性成分进行分离，并研究了其活性成分对山楂叶螨体内的保护酶的影响，旨在探索地肤子对螨类的作用机理，为新型植物性杀螨剂的开发提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

将试验所用地肤子洗净后在室内阴干(约25 ℃)，放入恒温箱内(40~45 ℃)烘干，磨碎，过60目筛，放入冰箱中储藏备用。

山楂叶螨为室内饲养的敏感品系：养虫室的温度(25±1) ℃，相对湿度50%±10%，光照条件L:D为18 h:6 h。

1.2 地肤子活性成分的分离

将植物干粉加入5倍量的氯仿，室温下(25±2) ℃浸提3次，每次3~5 d，过滤，合并3次的提取液减压浓缩，得氯仿提取物KFCE。

称取KFCE 10 g，采用常压开管柱层析法进行柱层析分离。洗脱后的流分经检测合并，收集流分KFCE-2，减压浓缩至稠状，待用。

1.3 症状观察

叶碟浸渍法(朱丽梅等，2002)：取平展的苹果(Malus pumila)叶片洗干净，叶面朝下放到水培养台上，每一叶片挑入成螨20头以上，待成螨稳定后，夹取叶片浸入药液5 s，对照为清水，将叶面朝下放到水培养台上，叶片边缘用湿棉条围住，防止螨体逃逸。从2 h到24 h每隔2 h观察1次成螨的状况，并记录其活动情况及反应。

1.4 酶活性测定 1.4.1 酶液制备

分别取触杀处理后4、8、12、16、20、24 h山楂叶螨雌成虫100头，根据测定的酶的不同，放入不同的溶液中，冰浴匀浆后，10 000 r·min^-1、4 ℃下离心15 min，取上清液备用(曹挥，2003)。

其中蛋白含量、蛋白酶和单胺氧化酶放入0.25 mL生理盐水中；谷胱甘肽-S-转移酶置于60 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.0)中；乙酰胆碱酯酶置于0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.5)中。

1.4.2 活性测定

蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝G-250法(李娟等，2000)。取酶液0.1 mL于试管中，对照管中加入0.1 mL磷酸缓冲液，5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，25 ℃水浴加热2 min，于595 nm波长处比色测定OD值。根据标准曲线计算出蛋白质含量。

蛋白酶活性测定：取制备好的酶液0.05 mL，在37 ℃水浴中预热3~5 min，加入预热到37 ℃的酪蛋白溶液1 mL，混匀后置于37 ℃水浴中加热15 min，加入3 mL 10%三氯乙酸，混合后离心。取上清液1 mL，加5 mL 0.5 mol·L^-1碳酸钠，1 mL Follin－酚试剂，在37 ℃水浴中显色15 min。用分光光度计于680 nm波长处测光密度值，从绘制好的标准曲线上查处对应的酪氨酸微克数，确定酶活力大小。

谷胱甘肽-S-转移酶活性测定：参照慕立义(1994)的方法，27 ℃下，记录5 min内OD变化值。

乙酰胆碱酯酶活性测定：参照何玉仙等(2003)的方法，以Ache为底物，DTNB为显色剂，毒扁豆碱为抑制剂。反应条件为27 ℃，保温15 min，用1 mmol·L^-1的毒扁豆碱0.3 mL终止反应，在412 nm波长下测定光密度值。

单胺氧化酶活性测定：参照许妍姬等(2005)的方法，以MAO的特异性底物苄胺为反应底物，测定其反应产物苄醛的生成量。利用苄醛在紫外部分λ＝242 nm处的吸收高峰，测定酶作用反应后的光吸收值，测定MAO的酶活性，重复3次。

2 结果与分析 2.1 KFCE-2处理后雌成螨的症状表现

为了初步推测KFCE-2对螨类的毒理作用，观察了KFCE-2处理后雌成螨的症状表现，发现其对成螨的作用大致可划分为以下几个阶段：

静止期(0~4 h)：少数螨不停地运动，但大部分静止，足呈伸展放松状态，无明显反应；

兴奋期(4~8 h)：站立不稳，频繁爬动，步态失调，运动不停，四处扩散；

痉挛期(8~16 h)：过度兴奋，身体倾斜，运动失调，原地打转，身体重心抬高，足颤抖，有黑色排泄物，产卵量急剧下降；

死亡期(16~24 h)：身体逐渐收缩至死亡。

KFCE-2处理成螨后，先是静止不动，经过短暂地兴奋后，虫体大量进入麻痹期，经过长达8 h的麻痹期后，进入死亡期，而且产卵量急剧下降，蜕皮大量减少，有黑色排泄物。初步推断KFCE-2对螨的作用方式是多方面的，具有触杀、抑制生长发育、抑制繁殖等作用，可能会影响螨的神经系统、消化系统。

2.2 对山楂叶螨体内蛋白含量的影响

雌成螨经KFCE-2处理后，每隔4 h测1次蛋白含量，结果如图 1(a)所示。处理后的0~12 h之间处理组与对照组变化趋势大体相同，但处理组蛋白含量高于对照组，从12~16 h蛋白含量变化不大，16~24 h波动较大，尤其是处理20 h后，蛋白含量显著增高，在接近24 h时又急剧下降，但仍高于对照组。从总体变化趋势来看，处理后的蛋白含量与对照组相比有所增高。

2.3 对山楂叶螨体内蛋白酶活性的影响

蛋白酶是生物体内的主要消化酶系，蛋白质在蛋白酶的作用下，分解成为多肽或氨基酸，被肠壁细胞吸收。蛋白酶的升高或降低将直接影响生物体对食物中蛋白质的吸收和利用。

从图 1(b)可以看出，用KFCE-2处理雌成螨后，处理组蛋白酶比活力值比对照组高，在4 h时变化幅度较大，处理组是对照组的2倍，在8 h处理组比对照组有所下降，在24 h时处理组的蛋白酶比活力急剧上升，总的来看，蛋白酶活性在用KFCE-2处理后被激活。

2.4 对山楂叶螨体内谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性的影响

谷胱甘肽-S-转移酶是许多生物体内重要的解毒酶系之一，是生物体内的一类与抗性有关的初级代谢及次级代谢酶系。

由图 2(a)可以看出，用KFCE-2处理山楂叶螨雌成螨后，其体内谷胱甘肽－S－转移酶活性有先上升后下降的趋势，处理组的活性均高于对照组，尤其处理12 h时，对照组活性不足处理组50%。因此，KFCE-2对山楂叶螨雌成螨体内谷胱甘肽-S-转移酶有一定的激活作用。

2.5 对山楂叶螨体内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响

KFCE-2处理山楂叶螨雌成螨后，结果如图 2(b)所示，0~24 h，处理组螨体内的乙酰胆碱酯酶活性与对照组相比，变化趋势大致相同，但处理组均低于对照组，乙酰胆碱酯酶被抑制。4 h之前，对照组和处理组酶活力都有上升的趋势，处理组抑制程度不大，为对照组的72.6%，但从4 h以后，酶活力开始大幅度下降，尤其是12 h和20 h，其体内酶活性被强烈抑制，仅为对照组的25.5%和11.2%，24 h稍微有所回升，但与对照组相比，仍被抑制30.5%。因此，乙酰胆碱酯酶可能是KFCE-2在山楂叶螨体内的重要靶标之一。

2.6 对山楂叶螨体内单胺氧化酶(MAO)活性的影响

从图 3可以看出，用KFCE-2处理雌成螨后，对照组单胺氧化酶活性与对照组相比，有先降低后升高再降低的趋势。在4 h时处理组单胺氧化酶活性比对照组低0.01 OD·min^-1mg^-1，但8 h到12 h处理组的单胺氧化酶活性被激活，均高于处理组。在16 h时，处理组与对照组单胺氧化酶活性基本相同，20 h后处理组单胺氧化酶被抑制。

3 结论与讨论

外源有毒物质进入生物体后，对生物体的影响是多方面的。通过对KFCE-2处理雌成螨后的症状观察，可以看出地肤子活性成分对山楂叶螨可能具有多种作用方式，对神经、消化、生殖系统都有一定的影响。进一步的研究也证明了处理后的螨体内多种酶都发生了变化，引发了螨体内的一系列生理生化反应，最终导致其死亡。

蛋白酶是生物体内的主要消化酶系，其活性的升高或降低直接影响生物体对食物的吸收和利用。并且生物体在接近死亡时，体内大量细胞的生理机能衰退，导致蛋白酶活性急剧升高和蛋白含量下降，往往表现出高度的负相关(董育新, 1997)。从处理后蛋白含量与蛋白酶活性的变化趋势可以看出，二者在处理后负相关的特征十分明显，并且在4~8 h和20~24 h变化最为强烈，此时处理后的螨分别表现为兴奋期和死亡期；而从处理后蛋白含量与蛋白酶活性的变化可以看出，二者的指标与对照相比，基本都有所升高，蛋白含量升高可能是由于处理后激活了试螨体内与蛋白质合成有关的酶，而蛋白酶活性的升高可能是因为试螨在外源有毒化合物作用下(尤其在死亡前)体内发生了一系列生理生化反应，启动了体内细胞程序化死亡，导致蛋白酶大量表达(付昌斌等，2000)，也有可能是由于蛋白含量的增高刺激了蛋白酶的合成(王荫长, 2004)。

KFCE-2进入试螨体内可以激发谷胱甘肽-S-转移酶的活性，对其进行解毒作用。谷胱甘肽-S-转移酶是是螨类体内最活泼的解毒酶系之一，尤其在许多有机磷农药的解毒代谢中起重要作用(王荫长, 2004；Mannervick, 1985)。乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶是生物体内影响神经系统的2个主要酶。乙酰胆碱酯酶主要存在于中枢神经灰质、交感神经节等处(Kondo et al., 1995)，是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标(任晓霞, 2002)。单胺氧化酶被抑制，必然会引起传导阻断(许妍姬等，2005)。谷胱甘肽-S-转移酶、乙酰胆碱酯酶等活性增加是桔全爪螨(Panonychus citri)对甲氰菊酯产生抗性的主要原因(孟和生等，2002)。KFCE－2抑制了试螨体内的乙酰胆碱酯酶活性，单胺氧化酶活性在8~16 h活性有所激活，而在其他时间被抑制。

从整个试验的过程来看，在0~4 h之间，虽然乙酰胆碱脂酶与单胺氧化酶受到了一定程度的抑制，但抑制程度较小，而谷胱甘肽-S-转移酶被激活，起到解毒作用，螨体症状表现不明显，处于静止期；在4~8 h之间，单胺氧化酶活性从被抑制逐渐变为被激活，增加了对神经胺的去除，谷胱甘肽-S-转移酶也在继续解毒，但随着乙酰胆碱脂酶被抑制时间的延长，可能引起了突触传导不能正常进行，螨体进入兴奋期；8~16 h，试螨表现过度兴奋，运动失调，足颤抖，此时单胺氧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性虽然被强烈激活，但乙酰胆碱脂酶也被强烈抑制，中枢神经系统轴突传导逐渐被阻断，周缘神经正常突触传递受阻严重，出现痉挛症状；16 h以后，乙酰胆碱脂酶和单胺氧化酶的活性被抑制程度达到最大，而谷胱甘肽-S-转移酶被激活的程度最低，蛋白酶活性急剧升高和蛋白含量的下降，表明了螨体接近死亡，体内大量细胞的生理机能衰退，身体逐渐收缩，进入大量死亡期。从中可以推测，乙酰胆碱酯酶长时间地被抑制，引起了神经突触传递阻断，可能是KFCE－2引起试螨死亡的主要原因之一。