河北杨(Populus hopeiensis)是杨柳科山杨属的树种，为高大乔木，干形通直，材质轻软而细密，富有弹性。水平根系发达，抗旱耐盐，耐瘠薄，是黄土高原半干旱地区少有的能够上山栽植、生长稳定、可以成材的乔木树种(陈旭吉等，2003)，在林业生产和经营中占有重要地位，特别是在农田林网的经营中起着举足轻重的作用(冯谦等，2003)。

近几十年来，越来越多的人认为，用PEG模拟植物干旱逆境是可行的。通过随机标记的¹⁴C方法确定了PEG 4000-10000能模拟干旱逆境的原因是其可阻塞植物的输导组织(Atree et al., 1993；王瑾等，2005；朱教君等，2006)。在PEG渗透胁迫下，势必引起植物体内一系列的生理生化反应，以增强植物体的抗旱能力(龚子端等，2006)，但PEG渗透胁迫下，乔木树种的生理响应及其相关性分析还缺乏深入的报道。

本研究通过PEG 6000渗透胁迫处理河北杨枝条，测定在处理6、12、18、24 h时叶片MDA含量、膜相对透性、产生速率、抗氧化酶活性等指标，分析上述指标的变化规律，并探讨各指标之间的相关性，旨在探讨渗透胁迫对河北杨的伤害机理及树木自身的抗逆机制，从而为干旱等逆境下河北杨的培育提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料处理

在甘肃农业大学校园内，选取河北杨成年树，采集树冠中部向阳方向生长的整齐一致的枝条，分别用质量分数为5%、15%、25%的聚乙二醇(PEG)溶液进行渗透胁迫处理，期间的光照强度为120 μmol·m^-2s^-1，分别处理6、12、18、24 h，取叶片进行各项生理生化指标的测定。

1.2 相关指标测定方法 1.2.1 相对含水量(RWC)

烘干法(华东师范大学，1980)。

1.2.2 相对电导率

电导仪法(郝再彬等，2004)。

1.2.3 脯氨酸含量

采用茚三酮比色法(郝再彬等，2004)。显色后用UV-2450分光光度计测定520 nm波长处的光密度值，通过标准曲线计算游离脯氨酸含量。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量

采用硫代巴比妥酸法(郝再彬等，2004)。

1.2.5 可溶性糖含量

采用蒽酮比色法(王学奎，2006)。

1.2.6 产生速率

参照王爱国等(1990)的方法，测定环境中的光照强度为120 μmol·m^-2s^-1。

1.2.7 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮蓝四唑法(郝再彬等，2004)，以抑制氯化硝基氮蓝四唑(NBT)光化还原50%为一个酶活性单位；过氧化物酶(POD)活性用愈创木酚比色法(郝再彬等，2004)，活性的测定基于愈创木酚的氧化，在470 nm测定，以每g植物鲜质量中每min所含酶活性单位(U)表示。

1.3 数据处理

各项试验重复3~5次，数据采用SPSS统计分析软件进行相关性分析，取P＜0.1为相关，P＜0.05为显著相关。各数据均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 渗透胁迫对河北杨叶片水分含量的影响

植物组织相对含水量反映了植物体内水分亏缺程度，由图 1可以看出：不同质量分数PEG溶液处理下河北杨叶片相对含水量均低于对照；且随着PEG溶液质量分数的升高和胁迫处理时间延长，河北杨叶片相对含水量均呈不断下降趋势，但下降的幅度不同。随PEG质量分数增大，其下降幅度有所增加。

2.2 渗透胁迫下河北杨叶片相对电导率和MDA含量变化

细胞膜透性是反映细胞膜结构和功能的一个常用指标，水分胁迫首先引起膜脂过氧化作用，使细胞膜受伤害，导致膜透性增大，电解质外渗量增加。叶片中的丙二醛(MDA)含量是表征细胞膜的脂质过氧化程度的有效指标，其含量可表示膜脂过氧化作用的程度(Placer et al.，1966)。试验结果表明(图 2)：河北杨叶片细胞膜透性在3种PEG胁迫下均有显著升高，在胁迫24 h时达到了最大值。不同质量分数PEG处理叶片细胞膜透性增大幅度不同，25%PEG处理24 h时较对照升高达到175%，在处理12 h时较对照升高98.28%；5%和15%PEG处理24 h时细胞膜透性也显著高于对照。15%和25%PEG渗透胁迫处理后，河北杨叶片中MDA含量主要表现为随胁迫时间延长而增加，但5%PEG溶液处理后，MDA含量在胁迫12 h时达到最大值。

2.3 渗透胁迫下河北杨叶片产生速率的变化

伤害植物的机理之一在于启动膜脂过氧化或膜脂脱脂化作用(吕庆等，1996)。在胁迫进程中，河北杨叶片产生速率变化如图 3，在不同质量分数PEG溶液处理下河北杨叶片中产生速率均较对照大，随处理时间延长，各个处理的产生速率呈先增大，后减小，再又增大的趋势。低质量分数PEG胁迫下，河北杨叶片产生速率随处理时间的变化较小，而高质量分数PEG处理下河北杨叶片产生速率随处理时间的变化较为剧烈(图 3)。

2.4 渗透胁迫下河北杨叶片SOD、POD活性的变化

从图 4看出，各质量分数PEG溶液处理的河北杨叶片SOD活性随胁迫时间的延长呈先下降，后升高，再降低趋势。在胁迫18 h时，各质量分数处理的河北杨叶片SOD活性达到峰值，24 h时，叶片SOD活性显著下降。各质量分数PEG处理的河北杨叶片POD活性均较对照高，但随处理时间的延长其变化趋势不同，在胁迫处理前18 h各处理河北杨叶片POD活性均呈升高趋势，胁迫24 h，5%PEG处理的叶片POD活性仅有不显著的下降，15%和25%PEG处理的POD活性显著下降，其中25%PEG处理下降幅度最为显著。

2.5 渗透胁迫下河北杨叶片渗透调节物质的变化

脯氨酸在植物细胞中主要起渗透调节作用。脯氨酸含量的增加，可以增强细胞的渗透调节能力，对植物抗旱有益，为此曾有人提出以干旱时植物体内游离的脯氨酸的积累能力，作为选育抗旱作物的指标(汤章城等，1986)。结果表明(图 5)：不同质量分数PEG溶液处理下，河北杨叶片脯氨酸和可溶性糖含量均高于对照，且随着处理时间的延长，基本呈上升趋势，但两者也有一定的差异性。在胁迫的初期(6~12 h)脯氨酸和可溶性糖含量变化幅度很小，随着时间的延长(12 h)，脯氨酸和可溶性糖含量均有增加，但脯氨酸增加幅度较大(图 5)，胁迫后期(24 h)，脯氨酸含量变化稍有下降，但可溶性糖含量仍基本呈递增趋势。

2.6 各生理指标相关性分析 2.6.1 叶片相对含水量与各生理指标间的相关性分析

通过对河北杨叶片各生理指标与叶片相对含水量进行相关分析，结果表明(图 6)：河北杨叶片MDA与变化和叶片相对含水量表现出显著相关[R(RWC，MDA)=-0.992，R(RWC，)=-0.725]。MDA与变化随水分含量减少有明显的升高，MDA含量增加的84.94%[R²(RWC，MDA)=0.849]和速率加快的52.60%[R²(RWC，)=0.526]可能是由植物体水分的丧失引起的，这也可以解释为植物体水分的减少是导致其MDA含量增大和积累的主要原因。而叶片相对含水量与SOD、POD活性无显著相关性[R(RWC，SOD)=0.213，R(RWC，SOD)=0.325]，与可溶性糖及脯氨酸含量分别表现相关和显著负相关[R(RWC，可溶性糖)=-0.592，R(RWC，pro)=-0.859]。说明随着叶片中相对含水量减少，渗透调节物质可溶性糖及脯氨酸含量不断积累，以增加叶片细胞的保水能力。

2.6.2 叶片产生速率与抗氧化酶活性相关性分析

抗氧化酶活性与产生速率的相关性分析表明：随着超氧化物歧化酶(SOD)活性的增强，产生速率有所降低，且两者相关[R(SOD，)=-0.527]，而过氧化物酶(POD)活性增强，产生速率有轻微的减小，两者相关不显著[R(POD，)=0.454]。因此说明超氧化物歧化酶SOD对清除起到了更为主要的作用。

3 结论与讨论

植物对逆境的反应涉及到植物体内一系列生理生化变化。在水分胁迫下，植物通过增加细胞内溶质，比如脯氨酸和可溶性糖进行渗透调节被认为是一种抵抗水分胁迫的有效途径。游离脯氨酸是植物体内一种重要的氨基酸，当植物受到干旱胁迫时，可作为植物的渗透剂，参与植物的渗透调节作用(McMichael et al., 1997)。另外脯氨酸作为一种高亲水性物质，可防止细胞干旱时脱水(Leveitt，1980)，因此当植物受到干旱胁迫时会使植物体内游离脯氨酸积累增加。从脯氨酸的生物合成来看，干旱将影响脯氨酸的合成，最终造成脯氨酸的积累在干旱处理末期下降和停止。王霞等(1999)认为在整个干旱处理过程中，脯氨酸与可溶性糖积累进程不同，脯氨酸在干旱后期含量降低，而可溶性糖在干旱后期大量积累，对植物体渗透调节而言，严重干旱会使植物体渗透调节能力丧失，因此可溶性糖在干旱后期的大量积累可能是脯氨酸下降的补偿策略。这与本试验结果基本一致：不同程度的渗透胁迫处理条件下，游离的脯氨酸与可溶性糖变化规律有相似之处，同时也存在一定的差异性：相同的是各处理的脯氨酸与可溶性糖含量均随胁迫进程而增加。不同的是在中度胁迫下，游离脯氨酸先于可溶性糖积累，而在重度胁迫下，脯氨酸累积停止，而可溶性糖累积继续(图 5)。

在干旱胁迫下，细胞内自由基的产生和清除平衡受到破坏，积累下来的自由基首先攻击质膜系统，使其透性增大(Smart et al., 1983)，从而使细胞膜受到伤害，膜透性增大。逆境胁迫使活性氧产生过多，会造成活性氧清除不及时，从而引发膜脂过氧化链式反应进程，导致脂质过氧化产物MDA含量的增加。研究结果显示：在不同程度的渗透胁迫下河北杨叶片MDA含量呈增大趋势(图 2)，这与前人的研究结果是一致的。

细胞内活性氧水平大幅度提高可造成氧化胁迫，并引起脂质过氧化、蛋白质与核酸的氧化修饰以及细胞膜的破坏，而植物在长期的进化过程中也形成了一系列的抗氧化酶和抗氧化剂来对抗与清除活性氧(焦健等，2006a；2006b; Li et al., 2004)。干旱胁迫下，保护酶活性的变化因植物品种、胁迫方式、胁迫强度和时间而不同。整个保护酶系统的防御能力的变化取决于这几种酶彼此协调的综合结果(陈少裕，1991；蒋明义等，1996；张木清等，1996)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种能消除植物体内过剩的超氧阴离子自由基的酶，从而保护植物免受活性氧伤害，SOD的活性决定了和H₂O₂的含量，而和H₂O₂是Haber Weiss反应的底物，SOD酶活力与植物的抗逆性关系密切，因此它可能成为膜防护中心(Bowler et al., 1992)。许多研究发现干旱胁迫下SOD、POD活性先上升而后下降的现象，并且不同植物的表现不完全一致(顾继杰等，1996；聂磊等，2001；韩蕊莲等，2002)。本试验研究结果表明：SOD、POD活性变化在胁迫的进程中有所不同(图 4)，随着渗透胁迫加重，SOD活性变化随着胁迫时间的延长呈现先下降后升高再降低的趋势，而POD活性变化随着胁迫时间的延长先升高再降低，说明渗透胁迫破坏了保护酶系统的动态平衡。低渗透胁迫较高渗透胁迫对保护酶系统的动态平衡影响较小，变化也较平缓。相关分析表明：超氧化物歧化酶(SOD)与产生速率相关显著(图 7)，说明超氧化物歧化酶(SOD)催化发生歧化作用从而起到清除的解毒作用。

有关干旱胁迫对植物的伤害及其保护酶系统与植物耐旱关系的研究已有许多报道，结果都不尽相同。这可能与不同植物的抗旱机制有关(万美亮等，1999)。保护酶系统对自由基的清除能力的变化可能是植物抗逆性的共同机制。植物体在逆境胁迫下保护酶的作用，可能是通过它们之间相互协调且保持一个稳定的平衡态而实现的。

总之，在PEG溶液的渗透胁迫下，河北杨叶片相对含水量逐渐下降(图 1)，由此造成脂质过氧化产物丙二醛(MDA)积累(图 2)，细胞膜相对透性破坏(图 2)，而上述过程伴随着产生速率的大幅度增加(图 3)和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性的下降(图 4)；但在胁迫进行到18 h时，SOD、POD活性的升高(图 4)及脯氨酸和可溶性糖含量的增加(图 5)可以起到一定减轻伤害的作用。从相关分析结果看出，丙二醛(MDA)含量及产生速率与相对含水量均呈显著负相关(图 6)，而SOD、POD活性与相对含水量相关性不显著(图 6)；POD活性与产生速率相关性不显著，SOD活性与产生速率相关性显著(图 7)，可见河北杨对水分胁迫的响应是通过多种生理过程综合作用的结果，各个生理指标存在着一定的内在联系。