文冠果(Xanthocera sorbifolia)为无患子科(Sapindeceae)文冠果属植物，1属1种，落叶乔木或灌木，是我国特有的珍稀木本油料和药用植物(中国科学院中国植物志编辑委员会，1985；中国油脂植物编委会，1987)，可用作生产柴油、食用油和高级润滑油。文冠果是“十五”期间国家重点研究的生物燃油树种，种仁含油率为55%~67%(高伟星等，2007)。牟红香等(2007)研究表明：文冠果种仁含有11种油脂肪酸，其碳链的长度主要集中在C16~C18之间，适合生产生物柴油。文冠果食用油中的亚油酸是中药“益寿宁”的主要成分，具有极好的降血压作用。文冠果的适应性强，有抗旱、耐瘠薄和耐寒的能力(高启明等，2005)，种植文冠果可充分利用我国山地资源。随着食用油业、生物柴油业及药物成分生产业的开发，对其种子和苗木的需求加大，传统的播种繁殖不仅需种量大且耗费土地和时间，而体细胞胚发生途径是进行快速、大量繁殖的有效途径。本课题组已初步建立了文冠果体细胞胚发生的培养体系(顾玉红等，2004)。激素作为体细胞胚发生的重要调节因子，在植物细胞分化、体细胞胚的诱导和形态建成等过程中起关键作用(施小龙等，2002)，Ca²⁺可能是作为介导者之一通过调节基因表达来实现激素的信号传递(孙大业等，2001)。钙作为植物体内的第二信使，参与了细胞分化、分裂和形态发生以及植物抗逆反应等过程(李杉等，2003)。Anil等(2000a；2000b)研究表明：Ca²⁺是体细胞胚发生中重要的第二信使。李杉等(2003)研究表明Ca²⁺与枸杞体细胞胚的发生密切相关，邢更妹等(2004)研究表明增加培养基中钙的含量能加速枸杞体细胞胚的发生。

目前，关于文冠果体细胞胚发生过程中Ca²⁺的超微细胞化学定位研究尚未见报道。本文以文冠果种胚离体培养经2，4-D诱导体细胞胚发生的体系为材料，研究细胞分化和发育过程中Ca²⁺的动态分布，旨在探讨Ca²⁺与文冠果体细胞胚发生的关系，为优化文冠果体细胞胚发生的培养体系、加速快繁奠定工作基础，并试阐明与之相关的植物体细胞胚的形态建成机理。

由成熟的文冠果种胚诱导获得的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷胚。进行Ca²⁺的超微细胞化学定位。

1.2.1文冠果体细胞胚的诱导方法以文冠果种胚为外植体，在B₅+2，4-D 1 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的培养基上诱导产生非胚性愈伤组织(暗培养)；非胚性愈伤组织在B₅+2，4-D 0.5 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的培养基上发育成胚性愈伤组织；胚性愈伤组织在B₅+6-BA 1 mg·L^-1+NAA 0.25 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1的液体培养基中进行悬浮培养，摇床转速为90~100 r·min^-1，光照时间为14 h·d^-1，发育产生球形胚、心形胚和鱼雷胚。所有培养基pH值为5.80，1.1 kg·cm^-1高压灭菌15~18 min。

参照Tian等(1998)的方法，略有改动，采用焦锑酸钾沉淀法进行Ca²⁺的超微细胞化学定位。将材料用3%的戊二醛固定液(用含有2%焦锑酸钾的pH 7.6的K₂HPO₄缓冲液配制)固定6 h以上。pH 7.6的K₂HPO₄缓冲液洗样品10次，每次10 min。1%锇酸固定液固定3 h。pH 7.6的K₂HPO₄缓冲液洗样品3次，每次5 min。乙醇系列脱水的浓度为：30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%，每种浓度脱水15 min，100%丙酮脱水2次，每次15 min。Eppon 618树脂在60℃恒温箱中浸透24 h。样品在包埋板中，于70 ℃恒温箱内，进行聚合。Sorvall MT-6000型超薄切片机切成3 μm厚的切片，1%甲苯胺蓝染色，Laica显微镜下镜检定位后，切成60 nm左右的超薄切片。2%醋酸铀溶液染色60 min，蒸馏水洗净，柠檬酸铅溶液染色3~5 min，蒸馏水洗净，干燥，JEM-100 CX/Ⅱ型透射电子显微镜下观察照相。螯合试验：将载有切片的铜网置于60 ℃、0.2 mol·L^-1的EGTA(pH 7.9)溶液中处理1 h，二重染色后观察，黑色颗粒消失，位置出现空白斑，则黑色颗粒为钙沉淀。

文冠果种胚块在B₅+2，4-D 1 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的固体培养基上，切口处产生透明和淡黄色，质地柔软，易分散，表面光滑的非胚性愈伤组织(图版Ⅰ－1)；非胚性愈伤组织在B₅+2，4-D 0.5 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6 g·L^-1的固体培养基上，开始分化，发育成淡黄和黄色，质地柔软、易分散，表面不光滑的胚性愈伤组织(图版Ⅰ－2)；胚性愈伤组织在B₅+6-BA 1 mg·L^-1+NAA 0.25 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1的液体培养基中，继续分化和分裂，产生球形胚(图版Ⅰ－3)、心形胚和鱼雷胚(图版Ⅰ－4)。

图版Ⅰ   Plate Ⅰ   1.非胚性愈伤组织；2.胚性愈伤组织；3.球形胚；4.鱼雷胚；5.Ca2+分布在非胚性愈伤组织的细胞间隙和细胞壁，×8000；6a.胚性细胞。Ca2+分布在细胞质、质膜和细胞壁上，×12000；6b.胚性细胞。Ca2+分布在液泡膜上，×30000；7a.球形胚，Ca2+分布在液泡膜和细胞壁上，×6000；7b.球形胚，Ca2+分布在质膜上，×10000；7c.球形胚，Ca2+分布在细胞间隙中，×6000；8a.鱼雷胚的胚芽端，Ca2+分布在液泡膜、细胞质和质膜上，×1500；8b.胚芽端的Ca2+分布在细胞间隙中，×1500；9a.鱼雷胚的胚芽根端，Ca2+分布在根冠最外层细胞的外细胞壁和细胞间隙中，×1000；9b.胚根端的Ca2+分布在液泡膜和细胞质中，×5000；9c.胚根端的Ca2+分布在细胞壁和质膜上，×12000；10.用EGTA处理后，Ca2+颗粒消失，形成空白斑，×1500. CW：细胞壁；Pm：质膜；Vm：液泡膜；Is：细胞间隙；Cy：细胞质；N：细胞核 1.Non-embryonic callus(NEC);2.Embryogenic callus(EC);3.Globular embryo;4.Torpedo embryo; 5.Ca2+ distributed in cell walls and intercellular spaces of NEC,×8000；6a.Ca2+ distributed in the cytoplasm, plasma membrane and cell wall of EC,×12000; 6b.Ca2+ distributed in the vacuole membrane of EC,×30000; 7a.Ca2+ distributed in the vacuole membrane and cell wall of globular embryoid,×6000; 7b.Ca2+ distributed in the plasma membrane of the globular embryoid, ×10000;7c.Ca2+ distributed in intercellular spaces of the globular embryoid,×6000; 8a.Ca2+ distributed in the vacuole membrane,cytoplasm and plasma membrane in the embryo tips of torpedo embryoid,×1500; 8b.Ca2+ distributed in intercellular spaces in the embryo tips of torpedo embryoid,×8000; 9a.Ca2+ distributed in the outside cell wall and intercellular spaces in the radicle tips of torpedo embryoid,×1000; 9b.Ca2+ distributed in the vacuole membrane and cytoplasm in the radicle tips,×5000; 9c.Ca2+ distributed in the cell walls and plasma membrane in the radicle tips,×12000;10.The deposit of Ca2+ disappear and a blank area was formed after the treatment EGTA,×1500. CW：Cell wall；Pm：Plasma membrane；Vm：Vacuolar membrane；Is：Intercellular space；Cy：Cytoplasm；N：Nucleus

在文冠果的体细胞胚发生过程中，Ca²⁺的超微细胞化学定位结果表明：在非胚性愈伤组织中，非胚性细胞Ca²⁺的含量最少，集中分布在细胞间隙和细胞壁上，分布在细胞内的Ca²⁺很少，细胞间隙中的Ca²⁺沉淀颗粒大，细胞壁上的颗粒小(图版Ⅰ－5)。当非胚性细胞发育成胚性细胞时，Ca²⁺集中分布在细胞质、液泡膜、质膜上(图版Ⅰ－6a，6b)，细胞间隙和细胞壁的Ca²⁺分布少，细胞内Ca²⁺分布明显增多。

随着胚性细胞的分化和分裂，到球形胚时，Ca²⁺集中分布在细胞间隙、液泡膜和质膜上，且质膜上积累的Ca²⁺颗粒大，细胞壁和细胞质中Ca²⁺分布少(图版Ⅰ－7a，7b，7c)。球形胚继续分化分裂，发育成鱼雷胚。鱼雷胚的Ca²⁺含量增多，集中分布在胚芽端和胚根端。胚芽端的Ca²⁺集中分布在质膜、液泡膜、细胞间隙和细胞质中，细胞壁上Ca²⁺分布少(图版Ⅰ－8a，8b)；胚根端的Ca²⁺集中分布在细胞壁、细胞质、液泡膜和质膜上(图版Ⅰ－9b，9c)，细胞间隙Ca²⁺分布少，胚根最外层细胞的外侧的细胞壁明显增厚，其细胞壁的外侧Ca²⁺分布多(图版Ⅰ－9a)。同时，用EGTA溶液处理焦锑酸钙沉淀的切片，观察时未见黑色的Ca²⁺颗粒，出现空白斑(图版Ⅰ－10)，可见焦锑酸钙沉淀法作为Ca²⁺的定位方法是可靠的，本试验切片中出现的黑色颗粒为Ca²⁺。

非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织在Ca²⁺的动态分布上差别显著。植物体细胞胚发生的关键是胚性愈伤组织的诱导，胚性愈伤组织处于开始分化的状态，细胞命运已被决定，具有在不含激素的培养基上能够发育成体细胞胚的能力，而非胚性愈伤组织处于脱分化的状态，由非胚性愈伤组织发育成胚性愈伤组织是一个质的变化，二者在细胞形态、淀粉粒、蛋白质、钙等多方面存在着显著差别。胡萝卜(Daucus carota)(周艳等，2004)、花生(Arachis hypogaea)(林荣双等，2000)、杂交鹅掌楸(Liriodendron chinense×L. tulipifera)(陈金慧等，2003)和四合木(Tetraena mongolica)(李天然等，1997)的体细胞胚发生研究表明，胚性愈伤组织的淀粉粒多于非胚性愈伤组织；小麦(Triticum aestivum)(崔凯荣等，1997)、水稻(Oryza spp.)(李中奎等，1993)的胚性愈伤组织的可溶性蛋白质含量和合成速率都远高于其非胚性愈伤组织。枸杞(Lycium chinese)胚性愈伤组织在胚性细胞分化期和球形胚早期对外源Ca²⁺的吸收量为非胚性愈伤的4~5倍(邢更妹等，2004)。李杉等(2003)对枸杞体胚发生过程中Ca²⁺的浓度变化进行了观察，发现胚性细胞内Ca²⁺的浓度明显升高，同时从细胞壁至细胞膜和细胞质，以致细胞核内均有分布。本试验研究表明：文冠果体胚发生过程中Ca²⁺的浓度变化与枸杞的结果相似，即非胚性细胞的Ca²⁺比胚性细胞少，且集中分布在细胞间隙和细胞壁上，细胞间隙中的Ca²⁺沉淀颗粒大，细胞壁上的颗粒小；胚性细胞时期，Ca²⁺明显增加，集中分布区由细胞间隙和细胞壁转至细胞质、质膜和液泡膜上。综合分析枸杞和文冠果体细胞胚的研究结果，表明细胞内钙库中Ca²⁺的增加与胚性发生密切相关。余凡立等(1999)研究表明水稻的卵细胞在受精前Ca²⁺含量较少，受精后Ca²⁺含量明显增加，推测受精是导致水稻卵细胞中钙增加的原因。Dignners等(1997)研究表明玉米(Zea mays)的卵细胞受精后其钙浓度也瞬间激增，认为精卵融合是导致卵细胞钙激增的必要条件。体细胞胚发生作为与合子胚发生类似的系统，其信号传导应有相似之处，本研究推测：文冠果的非胚性细胞在2，4-D等化学信号的影响下，从培养基中吸收更多的Ca²⁺，通过Ca²⁺信号系统来启动与胚性相关的基因，从而发育成胚性细胞，为以后体细胞胚发生时胚芽、胚根、维管束等形态建成的需要做准备。至于Ca²⁺的增减及分布的位置是如何调控胚性愈伤组织发生的，尚需进一步研究。

球形胚和鱼雷胚是体细胞胚的2个重要发育时期，涉及体细胞胚极性的建立和子叶、胚芽、胚根等器官形态的初步建成，受到多个基因的调控，因此作为第二信使的Ca²⁺的动态分布也必然存在差异。李杉等(2003)研究表明：随着枸杞胚性细胞的分化和多细胞原胚的形成，Ca²⁺在细胞内的分布主要集中在质膜和液泡膜上；球形胚时期在细胞核中呈弥散性分布，表明Ca²⁺的变化与胚性细胞的分化和发育密切相关，推测Ca²⁺的时空分布对胚性细胞分化中的信息传递和调控相关基因表达起关键性作用。本试验研究表明：文冠果球形胚的Ca²⁺集中分布在细胞间隙、液泡膜和质膜上，且质膜上积累的Ca²⁺颗粒大，细胞壁和细胞质中Ca²⁺分布少；鱼雷胚时期的Ca²⁺集中分布在胚芽端和胚根端。综合枸杞和文冠果体细胞胚的研究，说明体细胞胚的分化和快速生长部位需要大量Ca²⁺的参与，钙作为第二信使或细胞构建的主要元素与体细胞胚的发育密切相关，适时、适量地提高培养基中钙的浓度，将利于体细胞胚的发生，而关于钙的用量及引导体细胞胚发生发育的机理有待于进一步研究。