桃(Prunus persica)原产中国，是我国主要水果种类之一。桃种质资源丰富，它的变种、品种及类型为李属之最，是栽培桃品种的重要来源。全世界共有品种3 000余个，我国约有1 000多个。我国栽培桃品种的果实综合品质与发达国家如美国、日本、西班牙等相比仍有较大差距。因此，提高果品质量，加速果品生产从数量型向质量型转变，改进品种选育手段势在必行，采用基于分子标记技术的新品种辅助选育与鉴别新技术是果树遗传育种的研究热点之一。

近年来，分子标记技术在桃品种鉴别、系统发育和分类、种质资源的遗传多样性、种质的保存策略、遗传连锁图谱构建等方面得到了广泛应用(程中平等，2002)。特别是多态性强、重复性好、操作简单的SSR标记技术在桃上的应用越来越普遍(俞明亮等，2006；Aranzana et al., 2003；Blenda et al., 2006)，同时，AFLP技术也继续在新品种的鉴别和系谱追索中应用(乔飞等，2006；Xu et al., 2006)。

桃是以自花授粉为主的植株，自然产生遗传变异的机会较小(Xu et al., 2006)，一般以成熟期及果实色泽上的变异为主。浙江省宁波市北仑区白峰镇黄大可于2002年在其桃园内的‘湖景蜜露’的树体发现一果实变异枝条，通过在毛桃(Prunus persica)上芽接繁殖形成株系‘北仑02-1’。经过4年的田间观察，该株系具有稳定的早熟和果实较大等优良性状。但该株系与当地现有品种尤其是该园栽植的‘湖景蜜露’是否存在遗传上的差异尚需鉴定。本试验以8个桃品系为材料，在比较‘北仑02-1’和‘湖景蜜露’的主要物候期和果实性状的基础上，结合SSR及AFLP这2种分子标记技术，对‘北仑02-1’和‘湖景蜜露’等当地栽培品种进行比较遗传鉴别，为该变异新品系引种和推广提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为‘北仑02-1’、‘早红宝石’、‘大团蜜露’、‘湖景蜜露’、‘玉露’、‘X2-5’、‘迟玉露’、‘大玉白凤’8个桃品种。前4种材料由浙江省宁波市北仑区白峰镇黄大可提供，后4种材料来源于奉化水蜜桃研究所。其中‘X2-5’为‘湖景蜜露’与‘玉露’的杂交种，用于验证SSR分析试验结果的可靠性。

本试验中的SSR引物由上海Invitrogen公司合成，用于AFLP分析的接头和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，EcoRⅠ、MseⅠ和Taq DNA聚合酶，20 bp DNA Ladder Marker均为TaKaRa(大连)公司产品，DNA-MspⅠMarker为NEB产品。

1.2 方法 1.2.1 主要物候期调查

主要调查‘北仑02-1’和‘湖景蜜露’的花芽萌动、叶芽萌动、始花期、盛花初期、盛花期、末花期、展叶期、新梢生长期和果实成熟期等主要物候期。

1.2.2 果实品质测定

选取无病虫害、无机械损伤、成熟度一致的‘北仑02-1’和‘湖景蜜露’各10个果实为材料。果实横纵侧径和果实质量分别用游标卡尺及天平测定；采用TC-P2A全自动测色色差计(北京光学仪器厂)测定果实的L^*(明亮度)、a^*(红绿偏差)和b^*(蓝黄偏差)值；用Brookfield公司的LFRA质构仪(美国产)测定果实硬度，圆柱形探头直径6 mm，去皮，每果测4个面；果实可溶性固形物(TSS)含量用手持折光仪检测，每果测定4个面。

1.2.3 DNA提取和纯化

用改良CTAB法提取基因组DNA，具体操作步骤按陈昆松等(2004)的方法进行。所提取的DNA采用CsCl超速离心法纯化，应用Beckman Optimal L-100 XP超速离心机和Type 100 Ti转头，于20 ℃下70 000 r·min^-1离心16 h。

1.2.4 SSR标记选择和PCR反应体系

根据现有桃分子连锁标记图谱中控制果实含糖量和果实色泽有关生物信息(Dirlewanger et al., 2004)，分别从桃第4、5、6连锁群各选择2个SSR标记，它们是UDP98-024、BPPCT015、CPPCT013、UDP97-401、CPPCT008、pchcms5。图谱位置和引物序列参考蔷薇科(Rosaceae)基因组数据库(http://www.bioinfo.wsu.edu/gdr)，只是反向引物在5′端添加GTTT，目的是保证PCR扩增产物片段大小稳定一致(Gao et al., 2005)。在20 μL PCR体系中分别加入10×Buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L^-1)0.2 μL，上下游引物(10.0 pmol·μL^-1)各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL^-1)0.1 μL，模板DNA(10 ng·μL^-1)2.0 μL。PCR循环条件：94 ℃ 2.5 min，57 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，35轮循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存备用。

1.2.5 AFLP分析

用于AFLP分析的引物序列参照Vos等(1995)，共选用了4个EcoRⅠ引物(E1-AAG；E2-AAC；E3-ACT；E4-ACG)和6个MseⅠ引物(M1-CTC；M2-CAA；M3-CTA；M4-CTT；M5-CAT；M6-CAG)构成的24个选择性扩增引物组合。AFLP具体操作参照鲍露等(2005)的方法进行。

2 结果与分析 2.1 ‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’的主要物候期比较

2006年的调查数据显示，‘北仑02-1’果实成熟期比‘湖景蜜露’提前了20多天，其他生物学特性则与‘湖景蜜露’基本一致(表 1)，虽然‘北仑02-1’和‘湖景蜜露’的主要物候期差异很小，但果实成熟期的不同可以说明两者具有差异性。2007年‘北仑02-1’果实成熟期是6月24日。

2.2 ‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’果实主要品质比较

‘北仑02-1’果型显著大于‘湖景蜜露’，相同成熟度果实硬度也显著高于‘湖景蜜露’；色差指标中L^*(明亮度)和b^*(蓝黄偏差)值与‘湖景蜜露’有明显差异；从果实外观上看，两者也有很大差异，即‘北仑02-1’果实顶部有红晕，而‘湖景蜜露’果实颜色霞红，红色分布较均匀；从总可溶性固形物(TSS)含量来看，‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’的TSS含量接近，分别为11.86和11.78 °Brix(表 2)。

2.3 SSR结果与分析

共选择6对已知连锁图谱位置的SSR标记重点鉴别‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’，其中3对获得清晰的SSR条带(图 1)。图 1-A中的BPPCT015、CPPCT013标记图谱显示，‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’、‘大团蜜露’、‘大玉白凤’具有一致的谱带，与‘早红宝石’、‘玉露’、‘迟玉露’、‘X2-5’的条带则明显不同。图 1-B中的pchcms5 SSR分析结果则表明，‘北仑02-1’与‘早红宝石’、‘大团蜜露’、‘湖景蜜露’、‘X2-5’等的谱带存在明显差异，与‘玉露’，‘迟玉露’一致。从品种‘湖景蜜露’、‘X2-5’、‘玉露’的带型来看，‘X2-5’具有其亲本‘玉露’和‘湖景蜜露’的2条条带，与其杂交种育种来源相吻合。从而证明pchcms5区别这些品种桃的可靠性较高，这也进一步表明‘北仑02-1’在这个遗传位点上与‘湖景蜜露’存在明显差异。综合这3个标记的带型分布，可以明确‘北仑02-1’不同于当地主要栽培品种。

2.4 AFLP结果与分析

为进一步分析‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’的亲缘关系，进行了24对AFLP引物分析试验，其中21对引物不能分辨‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’，3对引物(E3M4、E3M5、E3M6)显示这2个水蜜桃品系的区别，差异条带也很清晰(图 2)。引物E3M4扩增的AFLP图谱有4个明显的差异条带，其中‘北仑02-1’有3条，‘湖景蜜露’有1条。引物E3M5扩增的AFLP图谱显示‘北仑02-1’有2条特有条带，引物E3M6显示2品种各有1条特有条带。这表明‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’有明显的不同。

3 讨论

桃基因组小, 结构简单, 自交育性强, 单基因控制的质量性状多, 非常适合于遗传学研究。由于桃遗传基础较简单, 它的连锁图谱研究工作进行得较为深入, 特别是在欧洲国家开展了大量的图谱构建工作。以分子标记和重要经济性状的连锁图谱为标志的桃基因组研究已经为品种鉴定和分子育种奠定了良好基础，有些性状的标记已在育种实践中应用(李靖等，2005；Abbott et al., 2002)。采用AFLP标记、SSR标记或者多种分子标记相结合来进行桃指纹图谱构建、亲缘关系研究、性状标记、遗传连锁图谱构建已经有大量的研究报导(吴俊等，2004；Aranzana et al., 2001；Arus et al., 2003；Dirlewanger et al., 2004；Lu et al., 1998；Sosinski et al., 2000)。根据现有果实品质等经济性状的图谱位置，国际桃基因组推荐了46个SSR标记来评价桃种质资源和遗传分析(Pere Arus，个人通讯)，应用基因组核心SSR标记来评价我国丰富的桃品种资源和育种材料，并且和经济性状进行关联分析可以提高桃的育种和选择效率。

本试验选择6对桃基因组核心SSR引物来鉴别水蜜桃变异株系‘北仑02-1’，BPPCT015、CPPCT013没能在‘北仑02-1’、‘湖景蜜露’、‘大团蜜露’3个品种之间扩增出多态性条带，而pchcms5能在‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’DNA样品之间扩增出明显不同的2个条带，而此标记正位于控制果实外观颜色的基因位点附近(Dirlewanger et al., 2004)。SSR标记不仅检测简便，而且可以明确变异的区间，相关的性状可以从参考图谱中寻找，因此更具有利用价值。本文选择了已报道的位于4、5、6连锁群的6个SSR标记，在品种数量少的情况下可以区别。但如果应用在大批量的品种资源或2个品种的全面比较分析，应该在桃8个连锁群上分别选择一定密度的标记(如每10 cM一个标记)进行对比测试，就可以发现不同品种(系)在整个基因组范围的异同概况，并对性状的变异做出一些遗传解释。

与SSR分子标记相比，AFLP分子标记无须知道引物在植物基因组的图谱位置就可以筛选出更多的多态性条带，成为品种鉴定的强有力工具(徐红梅等，2003)。然而AFLP分子鉴别对DNA模板质量要求比较高，桃叶片含多糖和酚类物质较多，采用一般的纯化方法不能很好地除去多糖，达不到AFLP分析所要求的纯度，为此，本试验采用了CsCl超速离心法进行DNA的纯化，达到较高的纯度，后继的酶切充分，预扩增和选择性扩增结果正常。从本试验AFLP图谱结果显示，选择性扩增引物的最佳组合是E3M4、E3M5、E3M6，它们均能在基因组水平上区分‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’。但这些AFLP标记在连锁群的位置不清，不能利用参考图谱已有的性状位点信息。

4 结论

经连续4年的生物学特性观察记录，发现‘北仑02-1’变异株系成熟期早，比‘湖景蜜露’提前20多天，大果型等优良性状具有稳定性。在基因组水平上‘北仑02-1’与‘湖景蜜露’及其他当地品种有差异。综合物候期调查、果实品质测定和遗传分析结果，认为‘北仑02-1’可能是一个变异新品系，但有关其变异的来源、原因和范围将在大量桃品种基因型鉴定中进一步研究。