随着石化能源的日趋枯竭和生态环境的日渐恶化，可再生且清洁的生物能源的研究开发已成为近年来的热点课题，以植物油为主要原料的生物柴油(biodiesel)以其优良的使用性能和环保效应倍受社会关注，已成为缓解液体燃油危机的重要途径之一。油脂作为植物的重要成分，主要以营养贮存物质积累于种子中。因此，种子的产量、含油量和脂肪酸组成等性状是入选生物柴油原料植物的关键指标。

小桐子(Jatropha curcas)又名麻疯树、膏桐等，是大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)多年生亚乔木(Openshaw，2000)，在我国主要分布于云南、四川、广西、广东、海南和贵州等热带和亚热带地区。小桐子种子含油量丰富，对其脂肪酸成分、理化性质、十六烷值等研究表明，小桐子种子油是制备生物柴油的理想原料(Banerji et al., 1985；Kandpal et al., 1995；Foidl et al., 1996；Kumar et al., 2003；Pramanik，2003；Akintayo，2004；Shah et al., 2004)。

种子油脂是以油体(oil body)的形式贮藏于胚乳、子叶或盾片等组织中(Huang，1996；Murphy et al., 1999)，被种子的萌发和幼苗生长利用(Wanner et al., 1981；Huang，1992)。油体外部包被一层磷脂和蛋白质镶嵌而成的半单位膜，脂肪酸以三酰甘油(triacylglyeerols，TAG)的结构储存其内(Tzen et al., 1992)。油体膜及膜上附着的蛋白占油体质量的1%~4%，这些油体蛋白约90%为油质蛋白(oleosin)，少量的为caleosin等其他蛋白(Millichip et al., 1996；Tzen et al., 1997；Chen et al., 1999；Naested et al., 2000)，它们共同参与油体结构的建成和生物学功能，并在油体的形成、稳定及油脂代谢利用过程中发挥关键作用(Tzen et al., 1992；Murphy et al., 1999；Frandsen et al., 2001；Floriana et al., 2007)。油质蛋白作为油体中的主要蛋白，已在多种植物中发现分子量不同的异构体，并对其在植物组织中的分布、蛋白结构和功能进行了研究(Tzen et al., 1990；1992；1993；1998；Abell et al., 1997；Wu et al., 1999；Floriana et al., 2007)。提取小桐子种子的贮油细胞器——油体和分离油体蛋白，有利于了解油体蛋白质的组成、种类、理化学等特性，为运用生物技术手段进一步改良品种，提高种子的油脂含量和改变油脂组分等打下基础。

本研究首次从小桐子种子中提取出油体，并分别采用聚丙烯酰胺凝胶单向(SDS-PAGE)和双向电泳(2D-PAGE)的方法对油体蛋白进行分析，报道了小桐子种子油体蛋白组表达谱，及各蛋白质的等电点、分子量和表达量等，为阐明油脂的储藏方式奠定了基础，也为培育更适于产业化种植的高油小桐子品种提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为采自四川省攀枝花市约40年树龄人工栽培小桐子的成熟种子，油体分离及蛋白提取时随机取不同植株的种子约10粒混合提取。

1.2 方法 1.2.1 油体的分离

参考Vesna等(2006)油体提取方法。取5 g种仁在15 mL匀浆液GMⅠ(1 mmol·L^-1 EDTA，10 mmol·L^-1 KCl，1 mmol·L^-1 MgCl₂，2 mmol·L^-1 DTT，0.6 mmol·L^-1 Sucrose，0.15 mol·L^-1 Tcicine-KOH，pH 7.5)中研磨成匀浆，加15 mL FMⅠ(0.4 mmol·L^-1 Sucrose，其他成分同GMⅠ)后，10 000 g离心30 min后取上层油层。油层重悬于15 mL GMⅡ(GMⅠ+2 mol·L^-1 NaCl)溶液，加15 mL FMⅡ(FMⅠ+2 mol·L^-1 NaCl)后，如上条件离心。上层油层重悬于15 mL GMⅠ溶液，加15 mL FMⅠ后，10 000 g离心30 min。然后取上层油层，室温重悬于15 mL GMⅡ溶液，振荡30 min。悬浮液如上离心。油体层悬浮于15 mL GMⅠ(4 ℃)，再加入15 mL FMⅠ(4 ℃)，10 000 g离心30 min。最终油体层悬浮于3 mL GMⅠ。

1.2.2 从分离的油体中提取蛋白

参考Tzen和Huang(1992)提取方法并有一定改进。0.5 mL分离的油体按1:1加入石油醚，振荡，13 000 g离心5 min后，去除上层石油醚相。重复此程序2次以上。用冷干机抽气5 min，除去残余的石油醚。加入0.75 mL氯仿/甲醇(2:1 V/V)，振荡，13 000 g离心5 min。富含蛋白的中间层重悬于0.25 mL水，加入0.75 mL氯仿/甲醇(2:1 V/V)，振荡，13 000 g离心5 min。重复加入氯仿/甲醇(2:1 V/V)振荡洗涤程序2次以上。最终，中间层重悬于0.5 mL水，超声波处理5 min。加入4倍体积的冷丙酮，于－20 ℃沉淀16 h以上。15 000 g离心20 min，所得蛋白沉淀冻干备用。

1.2.3 SDS-PAGE

参见Laemmli(1970)的方法。每块胶电流强度为10 mA，当溴酚蓝指示带接近胶板下沿时停止电泳。凝胶用染色液CBB-R250染色，脱色，扫描。

1.2.4 2D-PAGE

在Farell(1975)的方法上有所改进，第一向等电聚焦采用IPG预制胶条(11 cm，pH 4~7，pH 6~11，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，泡涨上样。电泳仪为Multiphor Ⅱ electrophoresis unit(Amersham Biosciences)，20 ℃恒温，电泳程序设置为300 V 1 h，600 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h(pH 6~11的胶条可延长至10 h)。等电聚焦完成后，取出胶条，在1% DTT的平衡缓冲液(6 mol·L^-1尿素，30% w/v甘油，2.5% w/v SDS，1% DTT，50 mmol·L^-1 Tris-HCl，pH 8.6)中平衡15 min后，转入2.5% IAA上述平衡缓冲液中平衡15 min。平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶(17%分离胶，4%浓缩胶)的上端，进行SDS-PAGE凝胶电泳，每块胶恒定电流25 mA。电泳完成后，取下凝胶，CBB-R250染色，脱色。

1.2.5 图像扫描与分析

脱色完成后凝胶用UMAX Power Look 2100XL扫描仪(MaxiumTech，Taipei，China)扫描(分辨率300 dpi)，然后用ImageMaster^TM 2D Platinum软件进行图像分析。

2 结果与分析 2.1 油体提取及其蛋白SDS-PAGE分离

采用改良Vesna等(2006)油体提取方法从小桐子种仁中得到乳白色的油体(图 1)，再用改良Tzen和Huang(1992)油体蛋白质分离方法从油体中提取蛋白质，经过SDS-PAGE分离后，共得到8条油体蛋白带，有4条主带Band 1、2、4、5，大小分别约为35、34、24、20 ku(图 2)。种子油体蛋白质主要为油质蛋白质，不同植物油质蛋白的分子量范围均在15~26 ku，被子植物中普遍存在2种不同分子量大小的油质蛋白异构体，且已证实异构体可在被子植物的同一油体上同时存在(Tzen et al., 1998)。参考Jolivet等(2004)和Vesna等(2006)的研究结果，认为Band 1、2可能为2种油质蛋白异构体，分子量分别约为20 ku和24 ku，后者的表达量为前者的2倍。表达量丰富的Band 4、5分子量分别为34、35 ku左右，相似大小的蛋白P34已从大豆(Glycine max)种子油体中分离得到，并且克隆了编码该蛋白的基因，核酸序列比对表明这种蛋白类似木瓜蛋白酶家族中的硫基蛋白酶(Herman，1987；Herman et al., 1990；Andrzej et al., 1990)。

2.2 油体蛋白2D-PAGE分离

利用双向电泳技术，进一步分析小桐子种子油体蛋白质组二维表达谱。首先用等电点为4~7的预制胶条分离小桐子种子油体中的酸性蛋白，ImageMaster^TM 2D Platinum软件扫描分析共得到74个可重复的蛋白点(图 3)。其中，表达最丰富的6个蛋白点的表达量占酸性蛋白的40%以上。再用等电点为6~11的预制胶条分离小桐子种子油体中的碱性蛋白，经ImageMaster^TM 2D Platinum软件扫描分析共得到79个可重复的蛋白点(图 4)，其中12个蛋白点与图 3中重复。表达最丰富的6个碱性蛋白点占碱性蛋白总量一半以上。

3 结论与讨论

本研究首次从重要的能源植物小桐子种子中分离油体和提取油体蛋白，并用电泳技术得到油体蛋白质组单向和双向电泳表达谱。SDS-PAGE结果显示，小桐子种子油体中包含油质蛋白的2种异构体，分子量分别约为20 ku和24 ku，后者的表达量约为前者的2倍。作为油体最主要的相关蛋白，可以推测从油体的发生到分解消失过程中油质蛋白起着重要的生物学作用。当种子萌发需要动员贮藏在油体内的脂类时，油质蛋白可能作为脂酶与油体结合的识别信号，也可能是脂酶的活化剂，促进油体解体(Huang，1992；Tzen et al., 1997；Thompson et al., 1998；Murphy et al., 1999)。在种子干化过程及储藏时，油质蛋白对稳定油体有十分重要的作用(Tzen et al., 1992；Murphy et al., 1999)，油质蛋白的数量直接影响油体的大小，从而影响油体的稳定性(Rodrigo et al., 2006)。

进一步采用双向电泳的方法从小桐子种子油体中分离到74个酸性蛋白和67个碱性蛋白，共141个蛋白点，等电点分布在5~10之间。由于油质蛋白在油体蛋白中含量丰富，且分子量为15~26 ku，因此推测图 3、图 4中含量最丰富的蛋白点有可能为油质蛋白。分析得知小桐子种子油体蛋白还具有如下特点：1)酸性和碱性蛋白种类相当，但碱性蛋白表达量更丰富；2)以低分子量蛋白为主，蛋白点集中在35 ku以下。

比较SDS-PAGE与2D-PAGE的结果，可以看到，SDS-PAGE仅能将油体蛋白粗略分为8条带，定性地反映油体蛋白分子量的组成情况。而2D-PAGE可以根据分子量和等电点的不同将其分离，清晰地呈现在二维凝胶上，再利用凝胶成像软件分析每个蛋白点的表达量，提供更大量的信息，成为小桐子种子油体蛋白的指纹图谱。因此，双向电泳具有更强大的分离分析蛋白质的能力。

要找到小桐子种子油体中参与油脂储存及利用的关键蛋白，需要对分离得到的蛋白作进一步的质谱鉴定来筛选出有意义的蛋白，如参与油脂生物合成的关键酶，在动员利用油脂过程中起作用的蛋白等。找到编码这些蛋白的基因，就能在分子水平上深入研究，改良小桐子种子品质，使之更适于大规模产业化生产。