菌根是土壤中的菌根真菌与高等植物营养根系形成的一种共生联合体，它是自然生态系统营养循环过程中的重要组成部分，对植物的营养获取和生长具有重要的作用(Smith et al., 1997)。菌根真菌可以从树木根系吸取自身所需营养及其他物质，而树木也可以通过菌根真菌获得更多的水分、磷素及其他物质。同时，许多菌根菌在生长及与寄主植物的共生过程中可产生植物激素，如细胞生长素、细胞分裂素、维生素B和吲哚乙酸等刺激植物生长。

有研究表明，吲哚乙酸能改变树木根系的形态(Baser et al., 1987)，修饰树木吸收根皮层的细胞壁和菌根菌的细胞壁构造(Durand et al., 1992)，使二者之间形成一个紧密的界面关系；细胞生长素也能改变树木根系的形态(Simpson，1974)，增加宿主树木与菌根菌间界面膜的渗透性(Craft et al., 1974)。但不同的菌根真菌甚至同一种菌的不同菌株，产生激素物质的能力可能不同。Ho等测定了须腹菌属(Rhizopogon)53个不同菌株产生IAA和细胞分裂素的能力，结果不同菌株的生产能力差异很大(陈永密，1978)。

本文选用9种外生菌根真菌对NL-895杨(Populus×euramericana cv. ‘NL-895')进行菌根合成试验，并对其在离体发酵培养条件下的激素物质含量进行测定，以探讨9种外生菌根真菌激素分泌能力的规律和差异及其对杨树苗木生长的影响，为深入揭示菌根真菌与林木的共生关系及其促生机理提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试外生菌根菌

本试验选用的9种菌根真菌分别来自我国西南、华东和东北等地，其中彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius，Pt₂)、华美牛肝菌(Boletus speciosus，Bs)、美味牛肝菌(Boletus edulis，Be)、紫金蜡蘑(Laccaria aemthystea，La)、黄须腹(Rhizopogen luteous，Rl)、褐环乳牛肝菌(Scleroderma luteus，Sl)、褐疣柄牛肝菌(Leccinum scabrum，Ls)和红绒盖牛肝菌(Xrocomus chrysentero，Xc)由南京林业大学森林病理实验室保存，头状秃马勃(Calvatia craniiformis，Cc)采自南京紫金山。

1.2 9种外生菌根真菌对NL-895杨苗木生长的影响

以杨叶片为外殖体，采用叶盘法繁育NL-895杨。苗龄5个月后炼苗(遮光缓苗48 h)移栽。移栽基质分为未灭菌的自然土和灭菌的基质2种。灭菌基质配方为砂子:草炭:蛭石=1:1:1(121℃下灭菌2 h)。苗木移栽20 d后用9种外生菌根菌的液体菌剂采用打孔注菌接菌法进行接种，对照施入未接菌的培养液；6个月后测量各处理的苗高、(地)茎粗及菌根侵染率(马磊等，2007)。

1.3 外生菌根菌的离体培养

采用液体振荡培养法扩繁菌丝体。将配制好的MMN液体培养基(付蕾等，1998)分别装至250 mL的三角瓶中，每瓶装入量为100 mL，然后在121℃下灭菌25 min。待培养基冷却后，将供试平板菌种用7 mm的打孔器接种于三角瓶内，并置恒温摇床(Thermoforma，美国产)上振荡培养，转速120 r·min^-1、温度25 ℃。每种处理6个重复，培养时间为1个月。

1.4 外生菌根菌分泌激素物质的提取

将9种外生菌根菌培养液中的菌丝体分别经真空抽滤后，用无菌水冲洗3次，滤纸吸干，在小研钵中加入5 mL 80%冰甲醇，研磨10 min，转至100 mL锥形瓶中，加入20 mL 80%的冰甲醇，摇匀，0 ℃放置40 h，不时摇动，然后过滤，滤液减压浓缩至10 mL，所得清液(每处理3个重复混合)测定结果为菌丝体中激素物质含量。

过滤菌体后的培养液连同冲洗菌体的洗液一起减压浓缩至10 mL，得分析液，其测定结果为培养液中的激素物质含量。

1.5 外生菌根菌所分泌激素物质的测定方法

将处理好的菌丝体及培养液的待测样品，采用高效液相色谱仪(Agilent 1100 series，美国产)测定(HPLC)其中的吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素(Z)和脱落酸(ABA)。其主要参数为：

层析柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，Analytical 4.6×150 mm (美国产)；流动相：20% CH₃CN，20% CH₃OH，60% H₂O，用H₃PO₄调pH为3.0；流速：0.7 mL·min^-1；检测器：UV 254 nm×0.1 AuFg；

将标准样品经HPLC分析，得出4种植物激素的标准曲线方程为：

式中，amt为浓度[μg·(100 mL)^-1]，height为峰高值。

将所得到的待测样品的分离色谱，以保留时间定性，峰高值定量，通过SPSS软件，结合标准曲线方程，计算出各处理的激素含量(弓明钦，1997；韩丽君等，2005；王有智等，1997；吴耕西等，1994)。

1.6 数据处理

将外生菌根菌所分泌植物激素的数据和各处理苗木生长指标的数据，用SAS软件进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 9种外生菌根真菌对NL-895杨苗木生长的影响

NL-895杨苗木接种外生菌根菌6个月后，菌根苗在高生长和粗生长上都与对照苗表现出了一定的差异(图 1)。由图 1可见，接种Rl的苗木其高生长与对照相比增幅最大，达到了70%以上；Ls、Sl、Pt₂、Bs、Cc和Be菌对杨苗高生长的促进作用次之；Xc和La对苗木高生长也有一定的促进作用。在各接菌苗的直径生长上，不同的菌根菌对苗木的影响也存在差异。Ls号菌对直径生长的促进效果最好，茎平均增粗0.15cm；其次为Sl、Rl、Bs、Cc和Pt₂；Be、La和Xc号菌对杨苗直径生长亦有一定促进作用。

通过对苗木根系菌根化率的测定发现，Xc、Be、Pt₂和La 4种菌根菌与NL-895杨根系形成了明显的菌根关系，其菌根化率在自然土中分别为68%，60%，70%和20%，在灭菌基质中分别为86%，80%，77%和44%；其余5种菌根菌与杨苗根系的菌-根结构关系不明显。但后者无论从苗高还是茎粗上都明显促进了杨苗的生长。显然，供试菌根菌与杨树苗木之间的动态互作关系，不仅存在着结构上的互作，还存在着与根际生态环境的其他代谢互作关系等。

2.2 9种外生菌根真菌分泌植物激素能力的比较

HPLC测定表明，9种外生菌根菌无论在培养滤液中还是菌丝体内，其分泌或含有的激素物质量均存在显著差异(图 2)。

吲哚乙酸是一种重要的植物生长素，可促进植物伸长生长。从图 2A可见，9种外生菌根菌均可分泌IAA，且在培养液中的含量均明显高于菌丝体中的含量。其中以Pt₂和Ls菌培养滤液中的IAA含量最高，达100 μg·(100 mL)^-1以上，Sl、Be和Rl次之，Bs、Xc、Cc和La的含量较低，为20~30 μg·(100 mL)^-1左右。9种菌根菌菌丝体中的IAA含量很低，在La、Bs、Cc、Rl和Pt₂的菌丝体中甚至未检测到吲哚乙酸。

赤霉素的主要功能是打破休眠，加速生长，从图 2B看出，在9种菌的培养液中GA含量较高，平均为1 172.4 μg·(100 mL)^-1。尤其在Be和Ls号菌的培养液中赤霉素含量分别达到2 277.3~2 473.0 μg·(100 mL)^-1；Rl培养液中吲哚乙酸含量最低，为116.1 μg·(100 mL)^-1；其他6种菌含量居中。在9种菌根菌的菌丝体中，赤霉素含量明显较低，平均只有33.5 μg·(100 mL)^-1，Xc号和Bs号菌的菌丝体含量稍高，其他几种菌菌丝体中赤霉素含量均较低，为12.2~20.9 μg·(100 mL)^-1。

玉米素对植物的主要作用是促进细胞的分裂与分化，研究发现玉米素在9种菌的培养液和菌丝体含量上是最高的，且培养液中的含量均大于菌丝体含量。在培养液中，Ls菌的玉米素含量近3 500 μg·(100 mL)^-1，其他几种菌含量也较高，为277.7~3 036.7 μg·(100 mL)^-1，最低为Rl，277.7 μg·(100 mL)^-1；在菌丝体中，Sl、Rl和Ls的玉米素含量相对较高，最高可达326.4 μg·(100 mL)^-1，而其他几种菌的平均含量仅为56.6 μg·(100 mL)^-1(图 2C)。

脱落酸可以抑制或促进生长，其浓度大时抑制茎、根、胚芽鞘或叶片的生长，但在低浓度时却可促进生根与下胚轴伸长等。从图 2D可以看出，脱落酸在9种外生菌根菌的培养液和菌丝体中的含量，与其他3种激素相比显著较低。其中La含量最高，但也未达到50 μg·(100 mL)^-1，而其他几种菌根菌含量都在17.8~43.9 μg·(100 mL)^-1。

许多研究证实：脱落酸是赤霉素的天然拮抗剂，而且脱落酸与赤霉素的合成有共同的前体(韩丽君等，2005)。通过比较图 2D和图 2B，可以发现9种外生菌根菌的脱落酸和赤霉素分泌量呈一定的消长关系。

2.3 外生菌根真菌产生植物激素差异及其与NL-895杨生长的关系

为探讨外生菌根菌产生植物激素的差异及其与NL-895杨生长的关系，将9种外生菌根菌产生4种植物激素物质(培养液与菌丝体中)的含量与NL-895杨苗高和地茎粗进行相关分析与回归分析。结果发现，不同的外生菌根菌及其所产生的4种激素物质含量与其对苗木的促生作用存在不同的相关关系。NL-895杨苗高生长与其地茎的粗度、菌根菌培养液中吲哚乙酸的含量及菌丝体中玉米素的含量呈极显著的正相关关系；杨苗地茎的粗度与其苗高及菌根菌菌丝体中玉米素含量也呈极显著的正相关关系(表 1)。

由于激素之间的相互作用及其对杨树生长的影响是复杂的，因此，采用多元线性回归分析的方法，进一步探讨4种激素在培养液和菌丝体中的含量(共8个变量)与杨树生长(苗高、地茎粗)的关系。

苗高多元线性回归分析结果表明，回归方程的相关系数R达0.948(决定系数R²=0.898)，F值为12.135，P值为0.000(表 2)，说明回归模型有统计意义。

从标准回归系数看(表 3)，菌丝体玉米素含量的标准回归系数的绝对值最大(0.982)，偏相关系数的绝对值也最大，与苗高呈极显著的正相关关系(P=0.000)，说明它对苗高的影响最大；而菌丝体ABA含量和菌丝体IAA含量则与苗高呈极显著的负相关关系(P < 0.01)。

茎粗多元线性回归分析结果表明，回归方程的相关系数R达0.964(决定系数R²=0.929)，F值为17.904，P值为0.000，说明回归模型有统计意义(表 4)。

从标准回归系数看(表 5)，培养液赤霉素含量的标准回归系数的绝对值最大(1.271)，其对粗度的影响最大，其次为菌丝体玉米素含量(1.249)，它们与杨苗茎粗均呈极显著的正相关关系(P < 0.01)；而菌丝体ABA含量、培养液吲哚乙酸含量和菌丝体吲哚乙酸含量则与茎粗呈极显著的负相关关系(P < 0.01)。

数据分析表明：在接菌苗木生长过程中，外生菌根菌所产生的植物激素，并非仅某一种在起主导作用，而是通过多种激素的动态平衡来促进苗木生长的。

3 结论与讨论

供试的9种外生菌根真菌均不同程度地促进了NL-895杨苗木的生长。通过对9种菌根菌分泌4种植物激素的研究发现，它们所分泌或含有的激素物质含量明显不同，且在培养液中的分泌量均明显高于其在菌丝体中的含量，差异显著。在其中5种菌的菌丝体内甚至未检测出吲哚乙酸。这说明菌根真菌所产生的植物激素可释放到细胞外，通过菌根共生体系，这些激素可进入植物组织中(王有智等，1997)。

外生菌根菌对杨苗促生效果的相关分析显示，菌根菌菌丝体中的玉米素含量与NL-895杨苗高和茎粗呈显著的正相关关系，而菌丝体中的脱落酸和吲哚乙酸含量等则与NL-895杨苗高和茎粗呈显著的负相关关系。在激素物质分泌量较高的5种菌根菌中，Be、Xc和Pt₂可与供试杨树苗木较好地形成菌根关系，说明外生菌根菌形成的这些生长调节物质可能对共生关系建立初期双方的相互识别起到潜在的直接信号分子或间接的信使作用(Beyrle，1995)。而激素物质分泌量较少的几种菌虽与苗木的菌根化程度不明显，但也都较好地促进了苗木的生长。Levisohn(1953)曾用黄色须腹菌对美国扁柏(Chamaecyparis lawsoniana)和美国侧柏(Thuja occidentalis)进行菌根菌接种，结果它们虽不能形成外生菌根，但对幼苗生长仍有明显的促进效果，从而证明生长素并非是在菌根形成后产生的。另外，Sl、Ls、Bs、Cc和Rl这5种菌在自然土处理中也可极少量地形成菌根，但在自然土的对照苗和灭菌基质的处理中未发现有菌根形成，其原因可能为自然土中的根际微生物与这5种菌存在某种互作促进效应，从而使其与苗木形成了菌根关系。

综上表明：菌根真菌对苗木的促生作用一方面可能表现为通过形态结构的变化(形成菌根扩大吸收面积)来促进生长；另一方面可能通过内含激素或分泌激素或几种激素物质的协调配合与苗木根系发生作用或改善苗木根际微生态环境来促进植物的生长。再者，由于从试验一致性角度考虑，9种外生菌根菌的培养均是在同一条件下(如25 ℃)进行的，但可能存在有的菌生长适温高于25 ℃或低于25 ℃。因此，某些供试菌的激素分泌情况可能与培养条件受限有关。对于菌根菌接种苗木后植物体本身激素的变化状况则有待进一步研究。

3种对NL-895杨苗高和茎粗促生作用较好的菌根菌(Rl、Ls和Sl)在培养液中所分泌的和在菌丝体中所含的4种激素物质含量各不相同。值得一提的是，上述3种菌根菌在其菌丝体中的玉米素含量均高于其他各菌。玉米素是植物体内主要的并可运转的细胞分裂素(Brenner et al., 1995)，其主要合成部位在根尖(周蕾等，2006)。而外生菌根菌与植物根系的互作部位也在根尖。因此，菌根菌产生的细胞分裂素可能由根尖经木质部运往地上部分产生生理效应。因而在外生菌根真菌所分泌的几种激素物质中，玉米素对杨树苗木促生作用的影响值得重视。