板栗(Castanea mollissima)是我国主要的经济林树种。我国板栗具有香、甜、糯的独特风味，品质高居世界之首，是我国出口创汇的主要果品之一。板栗是顽拗性种子，含水量高(通常可达40%~60%)，采后呼吸强度大，贮藏过程中极易失水、腐烂、发芽，丧失食用价值和商品价值。目前，通过冷藏、气调等贮藏方式已延长了板栗的贮藏保鲜期，甚至达到全年供应，但关于板栗货架期保鲜方面的研究还鲜见报道。发芽是板栗货架期最严重的问题之一，抑制板栗货架期发芽是实现板栗高效流通的重要措施。

板栗种子具有生理休眠特性，当生理休眠解除后，板栗在适宜条件下可以萌发。低氧、高CO₂、低温等环境条件可以诱导顽拗性种子产生次生休眠或强制休眠，进而抑制发芽(王贵禧等，1999)。板栗货架期环境温度较高，当板栗度过生理休眠期并从低温环境进入较高的室温环境时，在很短时间内迅速萌发，导致商品价值降低或丧失。种子休眠除受环境因素影响外，还与其本身的生理状态等密切相关。1960年，Villiers和Wareing在研究欧洲白蜡树(Fraxinus excelsior)种子的基础上，提出了发芽抑制物和促进物之间作用的概念；1968年，Amen提出种子休眠状态决定于内源抑制物和促进物的平衡，这一观点目前被人们普遍接受(彭幼芬，1994)。本文以“燕昌”板栗为试材，研究不同浓度NaOCl浸泡处理对板栗货架期发芽率与内源激素含量变化的影响，以期找出内源激素变化与板栗萌芽之间的关系，为板栗货架期保鲜提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

2002年9月26日采收于北京市昌平区下庄，品种为“燕昌”，采收后即入-2~0 ℃冷库，预冷48 h后装入打孔聚乙烯塑料薄膜保鲜袋(PE)中冷藏至次年5月上旬。出库时用NaOCl浸泡处理。

1.2 试验方法 1.2.1 处理方法

试验设3个NaOCl浓度：1 000、3 000、5 000 mg·L^-1。每个处理用果量10 kg，2次重复，将冷藏板栗于室温下(25~27 ℃)分别在3个不同浓度NaOCl溶液中浸泡20 min，取出晾干至恢复原重后装入打孔PE袋(孔径10 mm，孔数10个)于常温下放置。以不做任何处理为对照(CK)。

1.2.2 调查项目和测定指标

1) 呼吸强度  气相色谱法测定。将1 kg板栗放入干燥器内密封1 h，取1 mL气样用SQ-206气相色谱测定CO₂的浓度。色谱条件：FID检测器，温度120 ℃；GDX-502填充柱，温度70 ℃；转化炉温度360 ℃；载气为N₂(压力0.1 MPa)，燃气为H₂(压力0.105 MPa)，助燃气为空气(压力0.144 MPa)。外标法定量，重复6次。2)发芽率  随机取30粒板栗进行调查，以胚芽萌动即视为发芽，统计发芽率。3)激素含量植物激素酶联免疫测定法(ELISA)(试剂盒及测定方法由中国农业大学农学与生物技术学院提供)测定脱落酸(ABA)、赤霉素(GA₃)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)。激素的提取：称取0.2 g板栗胚芽鲜样，加2 mL提取液[80%甲醇，内含1 mmol·L^-1 BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度)]，冰浴下研磨成匀浆，摇匀后在4 ℃下放置4 h，1 000×g离心15 min，取上清液记录体积。上清液过C-18固相萃取柱，过柱后的上清液转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥，用样品稀释液[100 mL PBS中加0.1 mL Tween-20，0.1 g明胶(稍加热溶解)]定容。

1.3 数据处理

本试验数据用SPSS软件进行统计处理，采用ANOVA进行邓肯氏多重差异分析。

2 结果与分析 2.1 NaOCl处理对板栗货架期呼吸强度的影响

从图 1可见，NaOCl处理结束时，各处理板栗的呼吸强度较对照略有升高，但无显著差异。在货架期间，1 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的呼吸强度变化趋势与对照相同，均在货架期6天时达到呼吸高峰，随后即下降，第9天以后又升高，但在整个货架期内1 000 mg·L^-1 NaOCl处理均显著低于对照板栗(P＜0.05)。3 000 mg·L^-1与5 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的呼吸强度变化趋势相同，在货架期3天时即出现呼吸高峰，在货架期6天以后呼吸强度变化较小，但前者显著低于后者(P＜0.05)。另从图中可见，对照和1 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗呼吸强度峰值出现在货架期第6天，而3 000 mg·L^-1和5 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗，由以上分析可知，高浓度NaOCl处理改变了板栗呼吸代谢的变化趋势，使呼吸高峰出现时间提前，并使后期变化相对稳定。

2.2 NaOCl处理对板栗货架期发芽率的影响

如图 2可见，NaOCl浸泡处理对发芽率有较大影响。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理完全抑制了板栗的发芽，在整个货架期内，该处理的板栗发芽率为0。其他处理组和对照板栗在货架期的前6天发芽率随时间的延长呈线性增加；货架期6天以后，对照板栗的发芽率不再增加，而处理组板栗的发芽率也只有少许增加。在整个货架期内，1 000 mg·L^-1 NaOCl浸泡处理的板栗发芽率始终低于对照和3 000 mg·L^-1 NaOCl浸泡处理；在货架期的前6天，3 000 mg·L^-1 NaOCl浸泡处理与对照板栗发芽率水平相当，没有显著差异，在此之后，3 000 mg·L^-1 NaOCl浸泡处理的板栗发芽率继续升高，而对照板栗的发芽率不再变化。货架期12天时，发芽率从低到高依次为：5 000 mg·L^-1 NaOCl处理(0%)、1 000 mg·L^-1处理(15.48%)、对照(18.06%)、3 000 mg·L^-1 NaOCl处理(21.62%)。由此可见，NaOCl浓度高低对板栗萌芽的影响非常大，当浓度相对较低(3 000 mg·L^-1以下)时，对板栗发芽的抑制作用很小甚至在货架期后期促进萌芽，浓度一定高时(5 000 mg·L^-1)即可完全抑制板栗萌芽。

2.3 NaOCl对板栗种子胚芽激素含量的影响 2.3.1 NaOCl处理对板栗胚芽ABA含量的影响

表 1可见，各处理和对照板栗货架期间ABA含量变化趋势不尽相同。对照板栗在货架期3天时ABA含量显著升高并达到峰值，此后则随着时间的延长逐渐缓慢下降，第9天以后迅速降低。1 000 mg·L^-1和3 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ABA含量在货架期前期较0天时显著降低，且显著低于对照和5 000 mg·L^-1NaOCl处理的值(P＜0.05)；二者分别在第6天和第9天时达到最大值后又迅速下降，直至货架期结束。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理在第3天和第9天时出现2个峰值，且第9天时的值显著高于其他。各处理和对照均在货架期第9天以后显著降低，第12天时ABA含量均较货架期开始时显著降低(P＜0.05)。以上分析可见，在整个货架期间，NaOCl处理浓度对ABA含量变化趋势的影响很大，就总体趋势而言，1 000 mg·L^-1 NaOCl处理使板栗ABA含量降低，3 000 mg·L^-1和5 000 mg·L^-1 NaOCl处理使板栗ABA含量增加。

2.3.2 NaOCl处理对板栗胚芽GA₃含量的影响

在货架期初始时，对照板栗GA₃含量显著降低，第3天以后又逐渐升高，第9天出现峰值后又略有下降。1 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗GA₃含量在货架期内显著低于其他处理和对照，在货架期的前9天随着时间的延长迅速降低，第12天时显著升高。3 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗GA₃含量变化趋势与对照相同，第9天时达到峰值，且在第6天和第9天的值显著高于对照(P＜0.05)。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗GA₃含量在货架期的前3天变化较小，第6天时降到最低，随后又显著增加，并在整个货架期内较其他2个处理保持较高的GA₃水平。由此可见，NaOCl处理改变了板栗货架期间GA₃含量的变化趋势，与对照相比，1 000 mg·L^-1 NaOCl处理使GA₃含量降低，3 000 mg·L ^-1和5 000 mg·L^-1 NaOCl处理使GA₃含量增加，其中3 000 mg·L^-1 NaOCl处理在第6~9天时GA₃含量显著高于其他处理和对照(P＜0.05)，这正与该处理板栗在第6天以后发芽率继续升高的结果一致。

2.3.3 NaOCl处理对板栗胚芽IAA含量的影响

表 3可见，NaOCl处理改变了货架期间板栗IAA含量的变化趋势。对照板栗IAA含量变化趋势为“W”型，即在货架期初始时略有降低，随后升高，第6天时达到峰值后迅速下降，第9天以后再次迅速升高。板栗IAA含量随着NaOCl浓度的升高而增加。1 000 mg·L^-1和3 000 mg·L^-1NaOCl处理板栗的IAA含量变化趋势基本一致，即在货架期开始后先降低，随后又升高，分别在第9天和第6天出现最大值后再次下降，直至货架期结束。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的IAA含量在货架期开始后即升高，第6天时达最大值，此后随时间延长逐渐降低，呈单峰型变化趋势。由此看出，低浓度NaOCl处理可使IAA含量降低并推迟峰值出现的时间，高浓度NaOCl处理使IAA含量升高，但并没有改变峰值出现的时间。

2.3.4 NaOCl处理对板栗胚芽ZR含量的影响

对照板栗在货架期开始后ZR含量急剧增加，第3天达到峰值后迅速降低，第6天时降到最低值，以后则随着时间的延长逐渐增加。各NaOCl处理的板栗ZR含量在货架期开始后均有不同程度增加，但变化趋势不尽相同。1 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ZR含量在第6天达到峰值，随后则迅速下降，直到货架期结束；而其他2个处理组的板栗ZR含量均在第3天时达到最大值，与对照相同。在此之后，3 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ZR含量随着时间的延长逐渐下降，而5 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ZR含量在第3天后急剧降低，到第12天时又急剧升高。以上分析可知，各处理的ZR含量峰值均显著低于对照(P＜0.05)，其中1 000 mg·L^-1 NaOCl处理推迟了ZR含量峰值出现时间，但1 000 mg·L^-1和3 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的ZR含量在货架期前期和中期均始终保持较高水平(表 4)；5 000 mg·L^-1 NaOCl处理在货架期前期和中期ZR含量显著低于对照(P＜0.05)。这与发芽率的结果一致。

2.4 NaOCl处理对板栗胚芽ABA/GA₃、ABA/IAA、ABA/ZR比值的影响 2.4.1 NaOCl处理对板栗胚芽ABA/GA₃比值的影响

从表 5可见，不同处理板栗的ABA/GA₃比值变化趋势不同。对照板栗ABA/GA₃比值在第3天达到峰值后逐渐降低。3 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ABA/GA₃比值变化趋势与对照基本一致，但在整个货架期内均显著低于对照(P＜0.05)。1 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ABA/GA₃比值峰值显著高于对照和其他处理(P＜0.05)，但出现时间推迟到第6天。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ABA/GA₃比值分别在3天和9天时出现峰值，且第9天时显著高于其他处理和对照(P＜0.05)。根据以上分析推测，板栗在货架期前期的萌芽受ABA的影响更大些，在中后期GA₃的影响逐渐加大，进而通过ABA与GA₃协同作用影响萌芽，而5 000 mg·L^-1 NaOCl处理在中后期保持了较大的ABA/GA₃比值，从而更好地抑制板栗萌芽。

2.4.2 NaOCl处理对板栗胚芽ABA/IAA比值的影响

从表 6可见，NaOCl处理降低了ABA/IAA比值。在货架期内，对照和5 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的ABA/IAA比值的变化趋势基本一致，即均在第3天时达到最大值，在第9天时出现第2个峰值；1 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗的ABA/IAA比值在第6天时最高，之后则急剧降低；3 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗ABA/IAA比值的变化较平稳，没有出现明显峰值，并从第6天以后逐渐降低。

2.4.3 NaOCl处理对板栗胚芽ABA/ZR比值的影响

从表 7可见，各处理和对照板栗在货架期内的变化趋势不尽相同，出现峰值的时间也不同。对照板栗的ABA/ZR比值在第6天达到最大值，随后急剧降低；3个处理中，1 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗ABA/ZR比值在货架期开始后迅速降低，到第12天时急剧升高，达最大值；3 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗在货架期开始后降低，随后逐渐升高，但变化较其他2个处理幅度小，在第9天时达到峰值；5 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗从第6天开始迅速增加，第9天时达到峰值，且峰值远远高于其他处理和对照。在货架期12 d时，除1 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗外，其他处理和对照板栗的ABA/ZR比值均较低，且没有显著差异。以上分析可知，与对照相比，1 000和3 000 mg·L^-1 NaOCl处理使ABA/ZR比值降低，而5 000 mg·L^-1 NaOCl处理使ABA/ZR比值在较长时间内(货架期的前9天)保持较高水平，这与发芽率的结果一致。由此推测板栗在货架期前期的萌芽受ABA的影响更大些，随时间的延长ZR的影响逐渐加大，进而通过ABA与ZR的协同作用共同影响萌芽，5 000 mg·L^-1 NaOCl处理可以在较长时间内保持较大的ABA/ZR比值，从而更好地抑制板栗萌芽。

3 讨论

板栗是顽拗性种子，当生理休眠期结束以后，板栗在适宜条件下可以萌发。通常种子在萌发过程中呼吸作用增强。但本研究发现，与对照相比，NaOCl处理使板栗呼吸强度降低，但不同浓度NaOCl处理对板栗呼吸与发芽的影响不同。低浓度NaOCl(1 000和3 000 mg·L^-1)处理促进了板栗萌芽，高浓度(5 000 mg·L^-1)NaOCl处理抑制了板栗萌芽，但呼吸强度反而较低浓度NaOCl处理的板栗高。研究结果表明：板栗发芽主要集中在货架期前期，除3 000 mg·L^-1 NaOCl处理外，其他处理和对照在货架期6天以后发芽率基本不再升高。呼吸强度除与萌芽有关外，还与板栗的衰老代谢相关。虽然对照板栗的发芽率低于3 000 mg·L^-1 NaOCl处理的板栗，但其呼吸强度却始终高于3 000 mg·L^-1 NaOCl处理板栗，这可能与其衰老进程较快(尤其在后期)有关。由此推测，NaOCl处理可能对板栗呼吸代谢产生影响，这一影响导致板栗呼吸升高的贡献大于发芽导致的呼吸升高，且与NaOCl浓度呈正比。但NaOCl如何影响板栗呼吸代谢还不清楚，高浓度NaOCl处理在抑制板栗发芽的同时是否加速了板栗的衰老代谢，这将是下一步研究的关键问题。

种子休眠与萌芽受形态结构、生理作用、生态因素等调节。激素的对抗作用是调节生物过程的一个重要因素。激素的协同作用是调节生物过程的一个重要因素。种子的休眠与萌芽是由赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和发芽抑制物(如ABA等)这三因素决定的，GA在调节种子萌发中起原初作用，抑制物起抑制作用，而CTK则起着解抑制作用(彭幼芬，1994)。ABA在种子发育、萌发和休眠等许多生理生化过程中都起着重要作用(郑郁善，1998；余朝霞等，2003)，而种子休眠的打破通常与ABA水平的降低相关(David et al., 2003；Zeevaart et al., 1988；刘永庆等，1995；Hocher et al., 1990)。GA和ABA的相互作用是调节从种子形成到萌发的生长过程转变的重要因素(Wang et al., 2001；David et al., 2003)。种子休眠的打破通常与ABA水平的降低相关。用ABA生物合成抑制剂处理可导致种子休眠能力丧失(Zeevaart et al., 1988)。在ABA的生物合成中，有缺陷的基因突变体对ABA的敏感性降低，导致种子过早萌发(Nambara et al., 2000；Jia et al., 2001)。另一方面，外源GA的应用常促进种子萌发，如冷处理和光处理促进种子萌发通常与外源GA的增加有关(Yamaguchi et al., 1998)。研究指出(吴奇等，1993)，CO₂对冷藏板栗的萌芽有明显的抑制作用可能与板栗胚内ABA相对含量升高有关。未萌动、萌动和发芽的板栗胚内ABA含量依次下降。50% CO₂处理可明显抑制板栗的发芽，并且明显提高板栗胚芽中ABA含量以及ABA/GA₃比值，而100%N₂冲击处理则显著促进板栗发芽，并使板栗胚芽中ABA含量下降和ABA/GA₃比值降低(梁丽松等，2004)。Khan的种子发育调节的三因子学说认为，种子的休眠与发芽是由赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和发芽抑制物(如ABA等)这三因素决定的。种子在萌发过程中，CTK代谢非常旺盛。CTK可直接参与种子萌发中各种物质和能量代谢的调节过程；也可通过与其他激素的相互作用，并参与基因表达的调控，在转录和翻译水平上影响着植物种子的生理状况与形态建成。激素间的相互作用对代谢有很大影响。本研究通过对4种主要内源激素含量变化的分析发现，NaOCl处理浓度对板栗货架期间内源激素含量变化有显著影响：1 000 mg·L^-1 NaOCl使板栗ABA、GA₃、IAA含量降低，并推迟了IAA和ZR含量峰值出现的时间；3 000 mg·L^-1 NaOCl处理使板栗ABA含量降低，使其他激素水平升高，这与其使发芽率升高的结果一致；5 000 mg·L^-1 NaOCl处理使板栗各激素水平有不同程度升高。这种影响使得各内源激素在整个货架期间的变化趋势发生改变，它们之间的协同作用共同影响板栗萌芽，导致不同浓度NaOCl处理板栗的萌芽能力发生改变。NaOCl处理降低了板栗货架期前期ABA/GA₃、ABA/IAA比值，并推迟其峰值出现时间；1 000和3 000 mg·L^-1 NaOCl处理还降低了ABA/ZR比值，而5 000 mg·L^-1 NaOCl处理使板栗ABA/ZR比值升高。5 000 mg·L^-1 NaOCl处理后板栗ABA含量和ABA/ZR比值升高。这一结果与板栗发芽率结果一致。由此推测，板栗货架期萌芽受几种内源激素的共同作用，但更易受ABA的影响。因此，影响板栗发芽的原因是多方面的，NaOCl处理影响板栗发芽的机理尚不明确，有待进一步研究。