四倍体刺槐(4x)(Robinia pseudoacacia)是由二倍体刺槐(2x)体细胞加倍而育成的刺槐同源四倍体(Kim，1975)。近些年来，李云等(2004)、郝晨等(2006)、张国君等(2007)、王秀芳等(2003)及张颖(2003)分别对其微体快繁技术、大小孢子发育阶段与花器形态的相关性、叶片营养含量及生长动态、不同栽培地区生物量及不同立地条件下的造林技术进行了研究，使四倍体刺槐的研究取得了较大的进展。但是，这些研究的目的大多集中在四倍体刺槐的栽培利用上，很少涉及与其有关的同源四倍体生物学问题。

植物染色体同源加倍后改变了植物的遗传物质结构，从而导致植物的部分性状发生变异(姜金仲等，2006；程治军等，2005)，全面描述和研究这些变异现象可为阐明同源四倍体性状变异发生的规律及原因奠定基础，并为进一步研究植物染色体同源加倍的生物学意义及利用同源四倍体培育植物新品种提供帮助。目前这方面已做的工作主要集中在少数几种农作物上，如水稻(Oryza sativa)(黄群策等，1999)、高粱(Sorghum bicolor)(常金华等，1999)、苦荞麦(Fagopyrum tataricum)(赵钢等，1994)及黄花菜(Hemerocallis citrina)(李爱华等，1998)等，而木本植物的相关报道较少。

四倍体刺槐作为植物同源四倍体研究材料具有一定的优势：1)与农作物相比，四倍体刺槐为多年生植物，可以在基因型不变的情况下，长期跟踪性状的发育情况，积累四倍体性状遗传变异资料；2)四倍体刺槐可以进行无性繁殖，有利于借助“有性创造变异，无性推广应用”开展新品种培育；3)四倍体刺槐不但具有较大的生产实用价值，而且已有相当的研究和应用基础，一旦有新品种育出，可立即转化为生产力。基于上述思考，本文对四倍体刺槐花器原基的分化过程及成熟特征的变异情况进行了常规和电镜扫描观察研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料

北京林业大学四倍体刺槐和二倍体刺槐试验林基地位于北京郊区，地势平坦，黄棕壤，暖温带亚湿润气候区，年平均气温11.5 ℃，年平均降雨量568.9 mm，冬春两季多干旱。试验材料采自该基地已连续开花4年的6年生纯林，林中四倍体刺槐原种系北京林业大学于1997年从韩国引进。2005年5月中旬，林分处于盛花期时，从具有典型四倍体刺槐特征的代表性单株上采集试验所用的小花。

1.2 研究方法 1.2.1 花蕾电镜扫描样品的制备

将从植株上取下的花蕾，放入FAA固定液，抽气后固定至少24 h，直接转入95%乙醇中过夜；在解剖镜下，剥去外轮的苞片、花萼等，暴露所需观察的不同时期的原基，以上操作均在95%乙醇中进行；然后转入100%乙醇脱水20 min，脱水后的样品材料依次放入乙酸异戊酯与乙醇体积比分别为3:1、1:1及1:3的混合液中各浸泡15 min，再在100%乙酸异戊酯中过夜；取出材料样品装进干燥篮中，放入Polaron CPD 7501型临界点干燥器的压力室中，注入液态CO₂直至淹没样品为止，将干燥器温度调至15 ℃持续15 min，再将温度调至40 ℃持续至液态CO₂充分气化；处理后的样品材料再经粘台、喷金、镀膜后，HITACHI(日立)S-800扫描电镜观察并照相。镜检观察内容包括：小花原基的分化过程，花器官的表皮毛、表皮细胞特征及小型器官的形态特征等。

1.2.2 花粉电镜扫描样品的制备

在花粉粒成熟时，从植株上取下花蕾，于室内阴凉处用小镊子取出花蕾内的花药，放入FAA固定液抽气后固定24 h；用质量分数为50%、70%、95%、100%乙醇顺序脱水，每级停留15 min；脱水后的花粉依次放入乙酸异戊酯与乙醇体积比分别为3:1、1:1及1:3的混合液中各浸泡15 min，再在100%乙酸异戊酯中过夜；取出花粉装进干燥篮中，放入Polaron CPD 7501型临界点干燥器的压力室中，注入液态CO₂直至淹没样品为止，将干燥器温度调至15 ℃持续15 min，再将温度调至40 ℃持续至液态CO₂充分气化；取出花粉粒样品，再经粘台、喷金、镀膜，HITACHI(日立)S-800扫描电镜观察并照相。镜检观察内容包括：花粉的大小、形状、表面纹理及小孔分布特征等。

2 结果与分析 2.1 花器原基分化过程变异的扫描电镜观察

花器原基分化过程变异是指四倍体刺槐花器原基分化的顺序与蝶形花科植物常规分化模式的差异，同种植物花器原基分化顺序一般是比较稳定的。

2.1.1 花萼的分化

3月下旬，采集未萌发的花枝，剖开三裂叶痕，再去除芽上覆盖的稠密表皮毛，可见露出的幼花序；经扫描电镜观察，在花原基最外侧已经形成小苞片(B)，小苞片的外表面长有许多表皮毛；在小苞片对面一侧(远轴端)已分化出3个扁平的半圆形突起，紧贴花中央部分的外侧，即花萼原基(S) (图版Ⅰ-a)；远轴端的3个原基生长较快，近轴端的2个原基形成较晚；随后基部逐渐增高形成杯状，上部形成5个突起，花萼上部向内合抱，逐渐遮盖花的中央部分，花萼表面具表皮毛(图版Ⅰ-b)。

2.1.2 花冠和雄蕊的分化

当花萼原基(S)形成较高的半圆形时，在花萼原基内侧的近轴端，先出现了发育较快的3个凸起，其中位于中间且正对中央的凸起是旗瓣原基，两侧的为雄蕊原基(As)(图版Ⅰ-c)。紧接着形成与花萼互生的4个半圆柱状的突起，即翼瓣原基和龙骨瓣原基(P)；几乎同时，在花瓣原基的内侧，与其交错而与花萼相对的部位生成5个半圆柱状的雄蕊原基(As)，随后在最靠近内侧又形成与花瓣原基(P)互生的5个较小的雄蕊原基(Ap)，看似两轮的雄蕊原基随后基部合生在一起，且远轴端的雄蕊原基发育较快，而近轴端的发育较慢，但后来差异很小，花瓣原基基部逐渐联合形成杯状(图版Ⅰ-d)。因此，花萼与花瓣互生，花瓣与早发育的外侧雄蕊互生，2排雄蕊互生排列，而花萼与外侧雄蕊对生，花瓣与内侧雄蕊对生。

在10个雄蕊原基中有5个生长较快，其上部由半圆形逐渐形成较扁平状，上部较宽，下部明显较细，这说明在刚形成药囊时，其基部已经出现花丝的分化(图版Ⅰ-e)；且花药内侧内陷与外侧一同继续增大形成药囊，同时，两药囊之间部分横向扩展为药隔，逐渐形成花药的雏形(图版Ⅰ-f，g)。随后，外侧雄蕊(As)相对于内侧的雄蕊(Ap)以及花瓣原基(P)发育较快(图版Ⅰ-h)。

2.1.3 雌蕊分化

心皮原基发育较早，当花瓣原基形成突起时，花中央部分已经生长隆起，顶部较尖，即为心皮原基(图版Ⅰ-i)，由于远轴端与近轴端生长速度不同，远轴端明显快于近轴端，使心皮的近轴面朝向花序轴，同时进行侧向生长，使近轴面的凹陷更深(图版Ⅰ-j)。横切面表明雌蕊伸长较快，顶端细胞分裂旺盛，已开始弯曲，将来形成柱头，随着花柱继续向上与两侧生长，心皮腹部开始形成凹陷，且边缘有向内联合形成子房的趋势，当雄蕊原基顶端已经形成药囊时，才逐渐联合，此过程较缓慢(图版Ⅰ-h)。

上述各种花器原基的分化顺序和方式与蝶形花科植物(王福青等，2000)的一般模式是一致的，没有明显的变异发生。

2.2 四倍体刺槐成熟花器表型变异的常规及扫描电镜观察

成熟花器表型变异有两方面的意义：一是四倍体刺槐成熟花器表型常规观察结果在本群体不同花朵之间的差异；二是四倍体刺槐成熟花器表型常规和电镜扫描观察结果与二倍体刺槐的差异。

2.2.1 苞片

呈条形、狭菱形或菱形，先端渐尖或锐尖，密被表皮毛，花瓣初裂前后脱落(但较二倍体刺槐晚)；每朵小花下面只有1个苞片，在复总状花序中，每个分枝总状花序以及每朵小花下面也分别有一个苞片，长至最长时为1.1~1.3 cm，二倍体刺槐为0.5~0.7 cm。

远轴面：有大量粗而硬的表皮毛；表皮毛为单细胞非腺毛，表面光滑，中空，先端渐尖，基部未见通常放射状排列的支持细胞(图版Ⅰ-k)，苞片顶端和两侧表皮毛分布较多，发育较早，中部和基部的表皮毛发育较晚。近轴面：有大量细而柔的表皮毛，表皮细胞较长、沿苞片长轴排列(图版Ⅰ-l)。和二倍体刺槐相比：二者苞片的综合性状基本相似，但四倍体刺槐的表皮毛和表皮细胞比二倍体刺槐稍长些。

2.2.2 花萼

萼筒钟状，具5齿裂，萼齿微成二唇状，小花露白前均为绿色，且裂口周围在花冠初露时略出现红色，上方的2枚萼齿较浅，但较二倍体刺槐宽，且先端渐尖，不同花蕾的萼齿深浅有所差异。

远轴面：有浓密细柔的表皮毛，分布和结构与苞片相似(图版Ⅱ-a)；而二倍体刺槐表皮毛则相对稀疏和粗壮一些(图版Ⅱ-b)。近轴面：几乎无表皮毛，表面略有褶皱，表皮细胞多为长方形，可见纵向的细胞壁褶皱较深，横向的较浅，宽度不规则，排列紧密(图版Ⅱ-c)；而二倍体刺槐则有稀疏的表皮毛，表皮毛分布靠近顶端，中部与基部分布较少，呈指状直立，多数基部有放射状排列的细胞，表皮细胞壁内陷、分布不均匀(图版Ⅱ-d)。

2.2.3 花冠

大部分为典型的蝶形花冠，花瓣为下降覆瓦状排列，白色，不同花的形状相似，各部均具爪，爪长约3 mm，较二倍体刺槐(2 mm)的长；旗瓣均为近圆形，先端凹陷的深度约3~4 mm，较二倍体刺槐(2 mm)的深，瓣与爪的长度比例在不同花蕾稍有差异，内侧中部的黄绿色斑较二倍体刺槐的深；大多数小花的翼瓣与龙骨瓣都是对称的，形似耳形，翼瓣的耳部具内弯褶皱，边缘与龙骨瓣边缘叠在一起。有近10%的花瓣出现变异现象，如旗瓣与翼瓣数目或长度变异，也出现两朵花合生的情况。

远轴面：有较密而长的表皮毛(图版Ⅱ-e)，因而看不到表皮细胞的详细形状；二倍体刺槐则几乎无表皮毛，表皮细胞多边形，向外突出，细胞表面回较粗，且排列紧密，未见角质层覆盖，表皮细胞之间有凹陷的沟(图版Ⅱ-f)。近轴面：表皮细胞具角质层蜡质光泽，细胞表面纹饰较少，褶皱较浅，偶尔有气孔分布(图版Ⅱ-g)；二倍体刺槐表皮细胞多边形，向外突出，表面纹饰与远轴面相似，但纹饰较远轴面粗糙(图版Ⅱ-h)。

2.2.4 子房

无毛，具柄，为单心皮单室子房，狭长，通常具有15~20个胚珠(二倍体刺槐为5~10)着生于腹缝线上，珠被内层由珠心基部产生，雌蕊基部蜜腺分泌具清香的花蜜。

成熟子房长度约为1.2 cm(二倍体刺槐为0.9 cm)，子房柄长度约为0.4 cm(二倍体刺槐为0.3 cm)，花柱长度约为0.9 cm(二倍体刺槐为0.7 cm)。子房的形态为橄榄形，侧扁，胚珠着生于内腹缝线上，胚珠弯生，边缘胎座，子房内壁表面凹凸不平，呈凹陷及褶皱状，表皮细胞形状不规则(图版Ⅱ-i)。二倍体刺槐的构造与四倍体刺槐相似，只是体积较小，所含胚珠较少。

2.2.5 柱头

柱头顶端半球形，周围具表皮毛，其顶端表面分布有许多乳突细胞，为柱头表皮细胞外壁向外剧烈突起形成，细胞表面上可见发达的粘性分泌物。在花蕾即将展开时，柱头上已有分泌物出现，而至花冠初裂时，乳液已在柱头上展开厚厚一层(图版Ⅱ-j)；并已有花粉粒粘在乳液上(图版Ⅱ-k)。比较之下，二倍体刺槐柱头的形状和四倍体刺槐相似，但体积较小。

有近5%的雌蕊出现变异现象，如具有2个柱头而子房合生，或柱头或子房不能发育成熟等。

2.2.6 花柱

花柱线形，表皮层由角质化的薄壁细胞构成，表皮细胞呈圆柱形, 表皮细胞之间凹陷较深，形成纵向的条纹(图版Ⅱ-l)。柱头周围及下部具表皮毛。二倍体刺槐花柱构造特征与四倍体刺槐相似，但长度较短、粗度较细。

2.2.7 花丝与雄蕊群

雄蕊10枚，花丝上部完全离生，其中9枚花丝基部连合，一枚花丝完全分离，因而为二体雄蕊A(9)+1；成熟雄蕊群花丝(图版Ⅲ-a)长约1.25 mm；花丝表面轻度角质化，表皮细胞近纺锤形，纵向伸展。二倍体刺槐成熟花丝(图版Ⅲ-b)长1.05 mm，与四倍体刺槐相比虽然空间分布较相似，但整体显得较为纤细且短。

2.2.8 花药

花药呈近似椭圆形，上部略窄，近轴面可见到被一不贯通的沟分隔的花粉囊，花粉囊表面角质层发达，致使表面粗糙；成熟花药各花粉囊外观饱满，在花粉囊连接处呈深沟状；在花丝上端的着生方式为底着药(图版Ⅲ-c)，花药的开裂方式为纵裂(图版Ⅲ-d)；雄蕊的变异主要表现在花药数量减少，花药与花瓣合生，无药室等。二倍体刺槐花药呈近似五边形，上部较四倍体刺槐更尖，花粉囊被上下贯通的纵沟分隔，表面角质层发达，较四倍体刺槐纹路更明显(图版Ⅲ-e)，没有发现四倍体刺槐花药中出现的变异。

2.2.9 花粉粒

花粉粒的外部形状表现出极大的差异：近金字塔形、一端较尖的近长方体形及不规则的多边形等等。其中大多数具3个萌发孔沟(图版Ⅲ-f)，孔沟长约22~30 μm不等, 有大量的花粉粒因败育而形态为畸形(图版Ⅲ-g，h，i)。二倍体刺槐花粉粒的形状几乎均一，近长球形或椭球形；极面观为三裂椭圆形，赤道面观为椭球形(图版Ⅲ-j)；均具三萌发孔沟，沟狭长，沟宽约0.5 μm，三沟近似等长，约16~17 μm，沿子午走向，汇于椭球的2个极顶。

以3个萌发沟接近正常的花粉粒为标准，四倍体刺槐花粉粒极轴长约32~34 μm，赤道轴长约24~26 μm。二倍体刺槐花粉粒极轴长约31~33 μm，赤道轴长约20~22 μm。

花粉粒外壁表面具明显的沟界极区，极区面上光滑无细网纹及小穿孔，在其他部分具细网状纹，或无网状纹饰；在沟区两端网纹消失，小穿孔分布较网纹区域小，中间带两侧出现网纹，沿沟两侧网纹消失；小穿孔大而深，孔膜不明显，且频度较高，孔径大小不均一，约0.075~0.15 μm(图版Ⅲ-k)。二倍体刺槐(图版Ⅲ-l)花粉粒表面纹理较四倍体刺槐浅而少，视觉上较为光滑；小穿孔为较浅的凹陷或小穴，且频度较高，孔径较为均一，约0.15 μm，具孔膜。

3 小结与讨论 3.1 四倍体刺槐花器原基的分化

四倍体刺槐花器分化的顺序是花萼→花冠→雄蕊→雌蕊；花器的分化顺序呈现一定的向心性(但不够典型)，与蝶形花科植物的正常分化模式(王福青等，2000)相比，没有明显的变异现象发生，说明二倍体刺槐染色体同源加倍后(变为四倍体刺槐)对花器原基的分化顺序没有明显的影响。

3.2 四倍体刺槐成熟花器常规观察特征的变异

从花器的数量看，四倍体刺槐的苞片、萼裂、花瓣、子房数目及小花的对称性与二倍体刺槐完全相同，均为↑K(5)C5A(9)+1, G (1:1:∞)。从花器的大小看，前者的苞片、花萼、花冠及子房均明显大于后者，这些与前人关于多倍体巨大性的报道是一致的(Zhen et al., 2007；Robert et al.，2007)。从花器的形态看，四倍体刺槐的花器变异比较丰富，表现为4朵小花合生、双叉柱头、部分花丝完全连生等，到目前为止，在二倍体刺槐中没有发现这些现象。这些花器变异在小花幼蕾期比较少见，只是到了花冠显露期以后才逐渐多起来。

3.3 四倍体刺槐成熟花器扫描电镜观察特征的变异

四倍体刺槐成熟苞片、花萼、花冠的电镜扫描特征与二倍体刺槐的差异集中表现在表皮毛的有无、多少、疏密、形态、大小和表皮细胞的形状、大小、角质化程度、细胞壁的纹饰及细胞间形成的沟回方面；具体表现为，四倍体刺槐各花器的细胞均较大，苞片、花萼及花瓣的表皮毛较长、粗而硬(除花萼远轴面外)，表皮细胞表面比较光滑，花器边缘的结构比较圆润；除这些外，其他特征的变异在2类刺槐之间没有明显的规律。

四倍体刺槐成熟的花药、花丝、雄蕊群、柱头及花柱这些很小的花器在数量上也与二倍体刺槐相一致，但体积却均表现出了多倍体的巨大性。巨大性具体表现为：花药形态结构更为丰满，药室空间较大；柱头的表面积加大，分泌的粘液较多；花丝、花柱本身及其表皮细胞均较长等。

四倍体刺槐花器的共同特征是表皮和内部组织细胞较二倍体刺槐大，所以，四倍体刺槐器官巨大性的基础可能是其细胞的巨大性。四倍体刺槐花器的这些变异必将对四倍体刺槐的生殖特性产生重要的影响，进一步研究这些影响的方式和结果具有一定的遗传育种学意义。

3.4 四倍体刺槐花粉形态结构的变异

通常情况下，植物花粉粒的形态结构是非常稳定的，因此，花粉的形态结构特征是区分近缘品种的重要依据之一(姜正旺等，2004)。但是，四倍体刺槐花粉的形态结构却表现出了极大的变异幅度，表现在2个方面。首先，四倍体刺槐自身花粉粒的形状结构之间表现出了丰富的变异：体积大小不一，形状多样，萌发孔沟的数量及位置不固定，外壁表面的纹饰特征彼此悬殊等。其次是四倍体刺槐花粉粒的形态结构与普通二倍体刺槐差异较大，在四倍体刺槐的花粉粒中，几乎找不到与正常二倍体刺槐花粉粒基本结构类型相同的花粉粒；二倍体刺槐自身花粉粒的形状结构极为规则，不同花粉粒之间很少变异，萌发沟的结构、位置均相当稳定，但四倍体刺槐在这些特征上均表现出了极大的不稳定性。

花粉粒遗传物质结构决定花粉粒的形态结构特征(姜正旺等，2004)，既然四倍体刺槐花粉粒的形态结构特征有如此丰富的变异，可以判断这些花粉粒的遗传物质结构也是有丰富变异的，这些遗传物质变异的一部分应该是来自四倍体刺槐花粉母细胞不规则的减数分裂过程(基因交换与重组、同源染色体分离紊乱及染色体畸变等)，这和现有关于植物同源四倍体减数分裂紊乱的论述(代西梅等，2006)是一致的。四倍体刺槐形态各异、遗传物质结构彼此不同的花粉粒参与四倍体刺槐的生殖受精过程，将会产生变异类型十分丰富、变异幅度非常大的实生后代，这种实生后代变异的过程有可能成为一种创造育种原始变异材料的途径。