杜仲(Eucommia ulmoides)为杜仲科杜仲属植物，不仅是名贵的中药材和提取天然橡胶的工业原料，也是重要的绿化和水土保持树种(张康健等，1997)。

从1956年起，全国进行了杜仲资源调查。并在此基础上，从1986年起，进行了杜仲优树选择和无性繁殖方法的研究。在无性繁殖方法研究中，代表性的研究有采用杜仲优树根段诱导根萌苗、嫩枝扦插繁殖方法和留根露头育苗技术(张康健等，1989；1991)；采用嫩枝扦插繁殖、嫁接繁殖和埋根繁殖方法(张再元等，1991)；采用植物组织培养技术繁育苗木(陈丕铃等，1991)，以及杜仲芽位换接法的嫁接繁殖方法(彭少兵等，2007)等。这些技术方法为开展杜仲的无性系选育奠定了基础。

在历次杜仲资源调查中，最初发现湘西有叶子带紫红色的杜仲(胡笃敬，1956)。随后，发现了杜仲树皮的自然变异，将杜仲按树皮粗细程度划分为粗皮类型、光皮类型和介于两者之间的中间类型(周政贤，1993；张康健，1990)；并在湖南慈利林场发现一株树叶为紫红色的杜仲(周政贤，1993；张康健，1990)。此后，发现杜仲树皮差异较大，按照杜仲树皮开裂状况划分为深纵裂型、龟裂型、浅纵裂型、光皮型(杜红岩等，1994；杜红岩，1996)；同时发现叶型、枝型、果型等性状上的自然变异，随即选择出巨叶、大叶、小叶、短枝、紫红叶、龙拐(枝)、大果、小果等变异单株(杜红岩，1996；李芳东等，2001)。

在全国杜仲资源调查的基础上，1986—1994年，选育出了华仲(1~5号)杜仲优良品种(杜红岩等，1994；杜红岩，1996；李芳东，2001)；1986—2002年，选育出了秦仲(1~4号)药用成分含量高与高胶型杜仲新品种(张康健等，1999；2001a；2002a)；1994—2006年，选育出华仲(6~9号)4个高胶型杜仲优良无性系(杜红岩等，2006)。1999年，选择了10个自然变异单株，并对这10个自然变异单株进行了无性繁殖；2000年，在无性繁殖的基础上，建立了无性系测定林。

杜仲是我国特有的药用植物，树皮为我国名贵药材。2005年，在国内外研究证实杜仲叶的药用有效成分与杜仲皮基本相同、药用功能基本一致的基础上，将杜仲叶正式列入《中华人民共和国药典》(2005年版)，并确定绿原酸为杜仲叶药材的标志性功效成分。所以，杜仲无性系的优劣主要应以药用有效成分含量为标准。但是，目前对于笔者所研究的10个杜仲自然变异单株无性系的性状比较，特别是标志性功效成分分析，至今未见有关报道。为此，在无性系测定林的基础上，于2005年对10个杜仲无性系性状与标志性功效成分的含量进行了研究，以期选择出观赏及药用杜仲无性系，现将研究结果汇总如下。

1 研究材料与方法 1.1 研究材料

在全国杜仲资源调查的基础上，1999年，根据形态和色泽选择出10个杜仲自然变异单株(周政贤，1993；杜红岩，1996)，在这10个杜仲自然变异单株(无性系原株)上采取接穗，用1年生实生苗作砧木，在苗木基部采用嵌芽接方法各繁殖了80~100株。2000年春季，将10个自然变异单株的无性系，在河南省灵宝市天地生态科技有限公司杜仲基地上进行栽植试验，试验采用完全随机区组设计，每一个自然变异单株无性系(每一处理)栽植20~25株，重复3次，即每一重复栽植6~9株，株行距3 m×3 m。从而建立了无性系测定林。历时6年的观测显示，各无性系性状与无性系原株均无差异，性状表现稳定。2006年6月，采用无性系接穗进行嫁接繁殖，2006年10月观察，其嫁接苗生长表现与原无性系均无差异，性状表现稳定。

无性系测定林，位于秦岭东延余脉(豫西丘陵山区的小秦岭)的灵宝市朱阳镇闫驮村，属杜仲天然分布区。根据灵宝市气象局和林业局林业调查资料，该地区属暖温带气候，年平均气温11.0~14.2 ℃，≥10 ℃积温4 530~5 140 ℃，无霜期200~210 d，年平均降水量550~700 mm。土壤多为褐土，中壤，土层深厚。海拔为800~1 080 m。

无性系测定林，6龄，已普遍开花结实。2005年3月开始观察，在每一处理各重复中随机选择1株，挂牌标明。2005年6月中旬，对挂牌植株，在各树树冠中部的东、南、西、北4个方向分别采集等量叶片(每株2 kg)，同时调查记录树高、胸径等，测量叶面积、叶柄长。测定含量用的叶片分别在90 ℃烘箱内杀青15 min后阴干，分植株粉碎，过40目筛后装袋封存，备用。

紫叶杜仲，据调查资料(周政贤，1993)，这一单株从种子出土后苗期叶片就表现为紫色。可以看出，紫叶杜仲可能是杜仲异花授粉、天然杂交的产物。

叶丛枝杜仲(即短枝杜仲)，在洛阳嵩县一杜仲芽变单株上发现(杜红岩，1996)。

1.2 主要仪器和试剂

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪(日本，SHIMADZU)，包括SPD-10AVP紫外检测器，LC-10AT_VP输液泵，7725i手动进样器。UV-2000型紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)，Module型超声波提取机(天津科贝尔公司)，WDY-500A叶面积仪(杭州)。

绿原酸标准品(德国，Karlsruhe公司)，芦丁标准品(上海试剂二厂)。色谱用水为双重蒸馏水，色谱甲醇(美国，Fisher公司)，色谱冰乙酸(天津，Kemiou公司)；提取用乙醇为分析纯(西安试剂厂)。

1.3 研究方法

1) 叶面积和叶柄长测量 每株分别选取50片有代表性的杜仲叶，用面积仪测量每片叶面积，计算50片的平均值记录为该株的叶面积，3株叶面积的平均值作为该无性系的叶面积；用游标卡尺测量叶柄长，计算50片叶柄长的平均值记录为该株的叶柄长，3株叶柄长的平均值作为该无性系的叶柄长。

2) 绿原酸的提取测定 分别称取于60 ℃真空干燥恒质量的样品0.500 g，按文献方法超声波提取(董娟娥等，2003)，定容至50 mL。用0.45 μm微孔滤膜过滤后，得待测液。

绿原酸含量测定采用反相高效液相色谱(HPLC)法(董娟娥等，2007)。色谱条件：色谱柱Nova-pak C₁₈(4.6 mm ×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水-冰乙酸(体积比为24:75:1)；检测波长240 nm；流速1 mL·min^-1；柱温：30 ℃。

3) 总黄酮的提取测定 采用纸色谱分离、硝酸铝-亚硝酸钠比色法(尉芹等，2001)。

1.4 数据分析

采用DPS统计软件的随机区组设计单因素试验统计分析和Duncan新复极差多重比较方法统计分析数据。

2 结果与分析 2.1 无性系性状比较

表 1给出了各无性系的性状差异分析。杜仲的树皮(光皮、粗皮)、叶形(卵形、长卵形、椭圆形、长椭圆形)、叶面积(巨叶、大叶、小叶)、叶色(紫叶、绿叶)、枝条(龙拐)等都有自然变异。各无性系间叶面积大小差异极显著，巨叶杜仲叶面积是小叶杜仲叶面积的3.7倍(图版Ⅰ-10，A，B)；叶柄长度差异显著，长柄杜仲是短柄(叶丛枝杜仲)的3.2倍，(图版Ⅰ－6)。胸径有显著差异，树高无显著差异。

为了直观比较各无性系的性状差异，将各无性系展示于图版Ⅰ，由图版Ⅰ可见：

紫叶杜仲，移栽后至今，每年春季刚抽生出的嫩枝绿色，嫩叶黄褐色，正面中脉黄绿色；成熟枝条、叶片正面呈紫色，背面和正面中脉为绿色，叶卵形，全株显得十分美观，胜似紫叶李(见图版Ⅰ－2，Ⅰ－12，B)，观赏价值极高。

叶丛枝杜仲，叶片密，叶柄短小，枝条节间短(节间长1.0~1.2 cm，)，为普通杜仲的1/3~1/2，呈莲座状的短枝，枝条粗壮呈棱形，冠形紧凑，分枝角度小，仅为25°~35°，枝叶密集葱郁，秀丽别致(见图版Ⅰ－6)，可作为园林观赏树种。

长柄杜仲，叶长13~24 cm，宽5.2~9.5 cm，叶柄长3.1~5.6 cm，叶柄细长似线，狭长叶悬挂枝间，迎风飘摇，极为壮观(图版Ⅰ－3)，具有很好的观赏价值。

大果杜仲(见图版Ⅰ－5，B)。果长4.5~5.8 cm，宽1.3~1.6 cm，果翅宽，种仁长1.3~1.6 cm，宽0.32~0.36 cm，厚0.12~0.15 cm，成熟果实千粒质量105~130 g，果大，仁大，出油率高，果皮多，胶丝含量多(李芳东等，2001；谢碧霞等，2005)，是提取杜仲油和杜仲胶的优良工业原料。

历时6年的观测显示，上述各无性系性状差异明显，表现稳定。并经研究能够利用芽位换接法大量繁殖苗木(彭少兵等，2007)。这种嫁接方法，不仅简便易行、成活率高，且生长迅速、长势好。

2.2 无性系标志性功效成分(次生代谢物)含量分析

1) 绿原酸含量分析 杜仲叶中富含绿原酸，是杜仲叶中主要的次生代谢物。绿原酸是杜仲叶标志性药用成分(《中国药典》，2005版)，所以，杜仲叶中绿原酸含量的多少是无性系优劣的主要标示。

不同无性系杜仲叶中绿原酸含量差异显著(表 1)。紫叶杜仲叶中绿原酸含量最高，其次为小叶杜仲和巨叶杜仲。10个无性系叶中，绿原酸含量由高到低的排序为：紫叶＞小叶＞巨叶＞南阳1号＞大果＞嵩县1号＞长柄＞叶丛枝＞龙拐＞大叶(图 1)。

可见，紫叶杜仲不仅叶色秀丽，可作用园林绿化中的观叶树种，且叶中富含绿原酸。绿原酸是天然抗生素，具有显著的抗菌、抗病毒作用(张康健等，2002b)。国外从咖啡豆中提取绿原酸，价值昂贵，约300~500元·g^-1。所以，紫叶杜仲的叶子(再生资源)用于开发绿原酸产品，将会大大提高杜仲的经济效益。

2) 总黄酮含量分析 杜仲叶中富含黄酮类化合物，是杜仲叶中主要的次生代谢物之一。不同自然变异单株无性系叶中总黄酮含量差异显著(表 1)。

紫叶杜仲叶中总黄酮含量最高，其次为巨叶杜仲和小叶杜仲。10个变异无性系叶中，总黄酮含量由高到低的排序为：紫叶＞巨叶＞小叶＞大果＞嵩县1号＞龙拐＞大叶＞南阳1号＞叶丛枝＞长柄(图 2)。

杜仲总黄酮中的主要类型是槲皮素。近年来，槲皮素的生物活性引起了国内外医学界的普遍关注。具有降血压、降血脂、保护心肌缺血再灌注损伤及抗心肌肥厚等作用，能明显抑制血小板聚集，起到抗血栓形成作用(赵德义等，2003)。所以，仅从紫叶杜仲叶中富含的总黄酮(槲皮素)用于提取杜仲黄酮(槲皮素)化合物这一点来看，就足以显示紫叶杜仲药用开发利用的美好前景。

2 结论与讨论

杜仲叶的标志性功效成分是植物次生代谢产物。次生代谢产物是在植物具有合成某种次生代谢物基因的前提下经环境诱导而产生(Farmer et al., 2003；Taguchi et al., 2001)，是植物适应生态环境、谋求生存的需要(张康健等，2001a; 2001b)。在自然生长条件下，植物的种质和遗传适应性是影响植物次生代谢物含量的关键因素(Spitaler et al., 2006)。生物学和生态学研究表明，种内变异是由遗传决定的变异和生态环境引起的表型变异的综合产物(肖小河，1989)。杜仲生长在一定的生态地理环境，在多年的自然选择和人工培育过程中，其品质的变异具有客观必然性，其种内变异虽然会产生外部形态上的变化，但在多数情况下也表现为生理生化上的变化(张康健等，2001b)。遗传因素的多态性和环境条件的多样性都能对植物次生代谢作用产生影响，而环境因素、遗传因素和表型特征三者之间是相互联系、相互影响的。杜仲不同无性系表型特征与其标志性功效成分含量的差异正好说明了这一点。

绿原酸在植物体内含量的高低预示着植物对外界环境适应能力的强弱(Petersen，2007)。不同无性系的杜仲绿原酸含量的不同是其适应环境的表现。

黄酮类化合物在植物体中因其结构的不同而呈现不同的颜色，如花葵素为砖红色、芍药花色素为紫红色、锦葵色素为蓝紫色(Schijlen et al., 2004)。该类化合物在植物体中的含量差异从生理生化的角度说明植物适应环境能力的高低(Spitaler et al., 2006)。紫叶杜仲可能是因为某种黄酮类化合物的含量较高而呈现出的叶色。这有待于今后继续研究，弄清叶色的变异机理，从而有可能培育出更加美丽的杜仲叶色。

杜仲自然变异的广泛存在启示人们，一方面应充分利用自然杂交或芽变产生的变异，按照一定的育种目标，挑选出符合人们愿望的、具有优良经济性状的群体或个体，并通过比较、鉴定和繁殖，选育出优良类型或优良品种来，直接为生产服务；另一方面也可以在人为控制下，有目的地去进行人工杂交创造新品种。本项目所研究的10个无性系为今后杜仲的杂交育种提供了优良的亲本资源。

通过对杜仲不同无性系的分析和标志性功效成分的比较，得出以下结论：从园林观赏价值考虑，紫叶杜仲、叶丛枝杜仲的树形和叶形奇特，园林观赏价值高，可作为园林绿化树种；从药用和保健食品开发利用价值考虑，紫叶杜仲富含绿原酸和总黄酮，可作为优良药用品种。所以，无论从药用价值上看，还是从园林观赏价值上来看，紫叶杜仲都是一个比较优良的变异型，可在全国杜仲主产区和园林风景区(点)进行示范推广。