梨是我国栽培历史久、面积大、产量高的果树之一。鸭梨(Pyrus bretschneideri ‘Yali')果实具有很高的食用和药用价值，并且价格低廉，是我国主要消费水果。而梨果实在生长发育及贮藏期间，时刻会受到病害的威胁。尤其是一些真菌侵染造成的病害，由于在生长期潜伏侵染，直至果实近成熟期和贮藏运输期发病，不易控制和防范，轮纹病(Botryosphaeria piricola)就是最严重的果实真菌病害之一(曹玉芬等，1999)。

植物潜伏病原菌活化与寄主组织生理状态有关，其中涉及到寄主组织抗菌物质含量下降和病原菌可利用物质增多(Van Loon, 1985；蒋跃明，1997)。同时，植物遭受病原菌侵染后自身会发生一些防御反应，包括：植物细胞壁结构的增强、植保素的合成、蛋白酶抑制剂及一些水解蛋白的诱导和积累(Pring 1980；Ye et al., 1989)。近年来有2种细胞壁水解酶即几丁质酶(chitinase)和β-1, 3-葡聚糖酶(β-1, 3-glucanase)在植物抗病中的作用受到广泛关注。这2种酶普遍存在于高等植物中，能够降解几丁质和β-1, 3-葡聚糖。在高等植物体中尚未发现几丁质的存在，β-1, 3-葡聚糖也只在细胞壁中少量存在，但这2种物质是绝大多数病原真菌细胞壁的主要骨架结构成分(Li et al., 2003)。几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶可通过水解病原菌细胞壁直接杀死真菌，其作用具有“协同性"(Boller et al., 1983)。果实生长发育不同阶段的抗病能力与果实的皮孔密度、总酚含量、糖酸含量以及过氧化物酶(POD)活性等密切相关(刘海英等，2003)。为了深入探讨梨果实自身抵抗病原菌的能力，笔者研究了鸭梨果实在生长发育期、贮藏期以及受轮纹病菌侵染后的几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶活性的变化，丰富和发展果实的抗病机理。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试梨：鸭梨果实采摘于河北省赵县无公害梨果研究所果园，盛花期4月18日，套袋期5月28日，采收期9月26日。梨果采收后当天运至中国林业科学研究院林业研究所采后试验冷库，入库温度10 ℃，梯度降温，30 d降至0 ℃恒温保存。

鸭梨轮纹病病原菌：轮纹病菌(Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola)，来自当地典型轮纹病病果，进行分离纯化(方中达，1999)，并经国家林业局林业菌种保藏中心鉴定。

1.2 试验方法

病原菌接种与取样：选择大小一致、健康的梨果实，经体积分数为75%的酒精表面消毒。用梨轮纹病菌孢子悬液(浓度为1×10⁵个·mL^－1)针刺接种于果实，用蘸有无菌水棉花团保湿，27 ℃贮藏。每个果实接种20点，重复接种6个果实，取病斑组织进行酶活性测定。

腐烂果不同部位取样：选取12个典型轮纹病病果，取其病斑组织、病健交界处果肉，以健康果肉为对照。

生长期取样：在幼果期、膨大期和成熟期(分别为盛花后20~70 d、70~110 d和110~150 d) 3个时期分别取样。贮藏期取样：贮藏期5个月，每月取样1次。每处理取样6个果，重复3次。

1.3 酶活性测定

1) 几丁质酶活性的测定 参考史益敏(1999)方法并略有改进。粗酶液提取：取4 g果肉，加20 mL 0.1 mol·L^－1的乙酸缓冲液(pH5.0)匀浆，于10 000×g离心10 min，弃去沉淀。将上清液透析过夜后，10 000×g离心10 min，上清液4℃冷藏。

取浓度为2.7 mg·mL^－1的脱乙酰几丁质1.5 mL，加入0.1 mol·L^－1的乙酸缓冲液0.5 mL(pH 4.5)，酶液0.4 mL，75 μmol·L^－1的叠氮钠溶液0.1 mL，混和。于37 ℃下保温2 h后，1 000×g离心2 min，取1.5 mL上清液，加入0.3 mL的1%脱盐蜗牛酶和0.15 mL的1 mol·L^－1磷酸缓冲液(pH7.1)，37 ℃反应1 h，以水解几丁质内切酶所产生的几丁片段。并以同样处理的包括底物和酶(加热失活)的反应为标准对照。加2 mL高铁氰化钾溶液，100 ℃水浴15 min，以蒸馏水为空白对照，于420 nm处读取光密度，按上述方法求得产生的N-乙酰氨基葡萄糖量，单位是U·mg^－1h^－1。

2) β-1，3-葡聚糖酶活性的测定 参考史益敏(1999)、陈见晖等(2004)方法略有改进。粗酶液的提取同几丁质酶。以昆布多糖还原释放出的还原糖量测定该酶的活性。0.2 mL酶液加0.2 mL含量1 mg·mL^－1的昆布多糖(Sigma公司产品，溶于上述醋酸钠缓冲液), 40 ℃反应1 h, 然后加0.15 mL DNS试剂终止反应, 沸水浴煮5 min, 冷却后加5.4 mL去离子水, 混匀, 测OD₅₀₀值。以反应时间零作参比, 1个酶单位定义为60 s内还原昆布多糖中释放出1 mol葡萄糖量所需的酶量, 单位是U·mg^－1·h^－1。

1.4 统计分析

采用SPSS(11.0)“one-way ANOVA"进行差异显著性分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析 2.1 果实受病原菌侵染后酶活性变化

1) 几丁质酶活性变化 从试验结果可以看出，未接种的果肉中几丁质酶活性较低。健康果实在接种轮纹病菌48 h后几丁质酶活性开始上升，在接菌72 h出现活性高，酶活性是未接种的2.7倍。接种72 h后几丁质酶活性开始迅速下降，但始终显著高于对照(P＜0.05)(图 1)。病斑处和病健交界处几丁质酶活性变化不显著，但均显著高于健康果肉(P＜0.05)(图 2)。鸭梨果实感染部位及其邻近组织的几丁质酶活性上升，可能是组织对轮纹病菌的一种生理诱导抵抗反应。

2) β-1，3-葡聚糖酶活性的变化 图 3为鸭梨果实接种轮纹病菌后组织中的β-1，3-葡聚糖酶活性的变化。结果显示，处理24 h时接种与未接种的果肉中酶活性变化保持一致，可能由于2组果实受刺伤处理后，自身产生的防御机制促使β-1，3-葡聚糖酶活性稍微增强，而后由于对照果实未受病原菌侵染诱导，果肉中的酶活性又下降至初始水平。而接种48 h后，梨果实病斑组织中的β-1，3-葡聚糖酶活性显著高于对照(P＜0.05)，并且在72 h时出现活性高峰，比未接种提高98.46%。图 4可以看出腐烂部位和病健交界处的酶活性分别达到3.68，4.08 U·mg^－1h^－1，显著高于健康果肉(P＜0.05)。说明病原菌的侵入诱导了感染部位及其邻近组织β-1，3-葡聚糖酶的活性。β-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁主要成分，其活性的升高与抑制真菌的生长密切相关。由此可见，在鸭梨果实中β-1，3-葡聚糖酶活性的增加与植物的轮纹病密切相关，β-1，3-葡聚糖酶的活性变化时程与几丁质酶活性变化时程基本一致。

2.2 梨果实生长期几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的变化

图 5为未受病原菌侵染的鸭梨果实在不同发育期的2种酶活性变化。几丁质酶在果实发育初期活性较低，而在盛花后50 d活性开始明显升高，在90 d时达到最大值4.93 U·mg^－1h^－1，并且在果实的近成熟期一直保持较高活性。β-1，3-葡聚糖酶在盛花后50 d以前出现小的活性高峰，在盛花后70 d下降至最低点，而后开始大幅度增加，在盛花后130 d达到最大值3.56 U·mg^－1h^－1，而在成熟时(花后150 d)活性下降至1.77 U·mg^－1h^－1。说明果实在近成熟期2种酶的活性都相对提高，对果实发育后期轮纹病的抵抗有重要作用。

2.3 梨果实贮藏期几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的变化

图 6为未受病原菌侵染的鸭梨果实在贮藏不同时期2种酶的活性变化。几丁质酶活性在贮藏第2个月时迅速下降至0.94 U·mg^－1h^－1, 然后缓慢上升；β-1，3-葡聚糖酶在贮藏第1个月时迅速上升，同样在贮藏第2个月时出现最低值1.25 U·mg^－1h^－1。2种酶同时在第3个月时活性略有升高，随后活性变化趋于平缓。在贮藏期间这2种酶的活性明显低于采前，对抵抗病原菌的能力减弱。

3 结论

几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶在植物抗病防御系统中的作用受到普遍关注。几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶通过水解病原菌细胞壁直接杀死真菌。几丁质酶可有效裂解真菌菌丝体，并释放出细胞内可溶性物质。许多真菌被分解的细胞壁碎片、几丁质酶的酶解产物(几丁寡糖或N-乙酰葡萄糖胺)均能诱导植物细胞中几丁质酶活性的提高，同时可能参与植物抗御某些病原真菌的生理过程, 并起到重要作用。β-1, 3-葡聚糖酶不仅能直接作用于植物细胞壁，而且其作用的产物(低聚糖)可作为诱导物诱导与抗病反应有关的酶类，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸-CoA联结酶(4CL)等的积累，由此对植保素、木质素等抗病物质的合成与积累，从而阻止病原菌进一步侵入和扩散, 起到抗御病害的作用(马汇泉等，2004；张少英，2005；Schlumbaum et al., 1986)。本研究结果表明：在接种病原菌48 h后果肉的几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶活性均显著高于未接种果实，表明鸭梨果实几丁质酶和β- 1, 3-葡聚糖酶受轮纹病菌的诱导活性后活性增高，且在病斑的邻近部位这2种酶的活性明显升高，说明这2种酶在感病或逆境条件下能最大限度地被激发。

本研究表明：几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶在鸭梨果实幼果期(花后20 d至50 d)的活性均处于较低值；果实生长在花后70 d至130 d几丁质酶活性一直保持较高活性，β-1, 3-葡聚糖酶在花后130 d出现活性高峰；果实发育成熟时几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶活性均有所下降。说明这2种酶主要与果实在膨大期和近成熟期的抗病性相关。鸭梨果实在贮藏期间，几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶活性在前2个月有迅速下降至最低值，而后增加的幅度不明显，随着鸭梨果实衰老速度加快，整体抗病性也进一步降低，在自然状态下潜伏侵入果实内部的轮纹病菌也能够在果肉中生长繁殖，导致果实发病腐烂。王艳娜(2007)对潜伏侵染期田间试验的研究表明，鸭梨轮纹病的侵染期为盛花后50~90 d，发病期在采后20~40 d，表明鸭梨果实在采前的侵染期和采后的发病期与几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶活性变化在时间上极为一致。此外，笔者研究发现，鸭梨果实中的苯丙氨酸解胺酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等与幼果期的抗病性密切相关，而在果实的发育后期及贮藏期活性显著减弱(祝美云等，2008)。因此，果实在发育的不同阶段与抗病性相关的防御酶的种类不同，且各种酶的活性的强弱变化明显。