当前，应用动物的被毛，借助显微技术(孙中武等，2003)、生物化学与分子生物学检测手段(李军林等，2001)，开展野生动物保护与管理等方面的研究受到越来越多的关注。羽和毛是动物的主要特征之一，具有保护、调节、感觉和排泄等生理功能，其主要成分是由氨基酸组成的纤维状的角蛋白，在形态和结构上携有一定的遗传信息。动物的羽、毛角蛋白是一类非常稳定的结构蛋白，是一种相当纯净的蛋白质资源，是物种鉴别中常用的衡量标准。研究表明，动物的羽、毛角蛋白在物种之间确实存在着一定水平上的差异，可以作为良好的遗传标记来区分物种，甚至识别个体(严品华等，2000)。因为动物的羽或毛样本可以通过非损伤性方式获得，对于活体动物或标本十分有利，为国际上研究濒危物种所普遍采用，受到越来越多的研究者重视(李明等，2001)。

有关动物羽、毛角蛋白组分差异的研究多集中于法医鉴定(Marcella et al., 1996；吴雪萍等，1996)、营养(张录强等，2004)以及基础医学研究(Rieck, 1997)等领域，利用角蛋白氨基酸含量差异进行野生动物分类学研究尚未见报道。本文利用高效液相色谱技术，对7种鹤和2种鹳羽角蛋白氨基酸组成和含量进行系统检测分析，来探讨不同种属动物羽、毛角蛋白的组成差异在野生动物分类、识别及在亲缘关系鉴定等方面的应用；同时，也期望本研究方法能在野生动物无伤害性研究中发挥更大作用。

1 材料与方法 2.1 试验材料

本试验采集的羽毛样本分别均为成年鹤、鹳飞羽。其中西非冠鹤(Balearica pavonina pavonina)和东非冠鹤(Balearica regulorum gibbericeps)样本为馆藏标本，由东北林业大学野生动物资源学院标本馆提供，其他样本为活体取样，采集自黑龙江省扎龙国家级自然保护区和哈尔滨动物园(表 1)。

1.2 研究方法

样品分别经过洗净、烘干、剪碎、称量和水解等预处理。将氨基酸水解液和氨基酸标准品依据AccQ·Fluor试剂盒说明进行衍生化处理，用Waters 600-717-2487高效液相色谱(HPLC)检测分析。紫外检测器检测波长248 nm；荧光检测器激发波长250 nm，发射波长395 nm。采用Excel 2003和SPSS13.0软件进行数据的处理及统计学分析。

2 结果与分析 2.1 氨基酸组成与含量

用HPLC分别对9种羽毛样本的角蛋白水解液进行检测分析，共检测出17种氨基酸(表 2)。对每种羽毛样本不同个体之间的氨基酸含量进行均值检验，未发现异常值。此外，馆藏鹤类羽毛样本与采集鹤类羽毛样本的氨基酸含量均值检验也未发现异常值。这表明氨基酸含量在同种动物不同个体间相对稳定，不同采样方式获得的样本对氨基酸含量没有影响。

2.2 氨基酸组成特征的对比分析

将9种羽毛样本氨基酸检测结果按HPLC检出顺序绘制以氨基酸含量为基础的点折线图，由折线特征及方差分析得出以下结论：鹤形目(Gruiformes)和鹳形目(Ciconiiformes) 2组样本的角蛋白氨基酸构成数据点折线各自有较高的一致性和规律性，其中Val、Tyr、Ile、His、Met、Pro、Cys、Ser、Asp、Phe、和Glu 11种氨基酸的含量在2组之间均表现有显著差异(P＜0.05)，其中His、Pro、Cys、Tyr、Val、Met、Ile的差异性更为突出(P＜0.01)，表现出明显的种属特异性。

直观上看，对于分属鹤科(Gruidae)以下的鹤属(Grius)与冠鹤亚科(Balearicinae)间的不同种样本，其角蛋白氨基酸构成数据点折线总体差异并不十分明显。多重比较分析表明，Pro(P=0.018)、Met(P=0.03)和Ile(P=0.017)3种氨基酸含量在以上2组样本之间存在显著差异(P＜0.05)。因此可以考虑将这3种氨基酸作为区分鹤属与冠鹤亚科的参考指标。

为了确认该结论的准确性和可行性，根据其他动物毛角蛋白氨基酸组成情况(景松岩，1992；高海钰，2001)，将鹤科、鹳科与鹿科、熊科共8种动物羽和毛的角蛋白氨基酸组成情况进行对比分析。结果表明，同属于鹿科(Cervidae)鹿亚科(Cervinae)鹿属(Cervus Linnaeus, 1758)的梅花鹿(Cervus Nippon Temminck, 1838)和马鹿(Cervus elaphus Linnaeus, 1758)的毛角蛋白氨基酸构成数据点折线一致性较强；同属于熊科(Ursidae)的棕熊属(Ursus Linnaeus, 1758)棕熊(Ursus arctos Linnaeus, 1758)和黑熊属(Selenarctos Heude, 1901)黑熊(Selenarctos thibetanus G. Cuvier, 1823)的毛角蛋白氨基酸构成数据点折线也有较强的一致性。鹤科、鹳科动物羽角蛋白氨基酸构成数据点折线与它们有着明显的不同，存在较大的差异(图 2)。方差分析表明，17种氨基酸含量在以上4个不同科的动物间存在显著差异(P＜0.05)，其中有16种氨基酸含量差异表现为极显著(P＜0.01)。

从以上分析可以看出：对于分类在不同科、属以上的动物，其羽或毛角蛋白的氨基酸含量存在着显著的差异，其氨基酸构成数据点折线具有明显的特征性；而在同一科、属以下动物之间，其羽或毛角蛋白的氨基酸含量差异性较小，氨基酸构成数据点折线呈较强的一致性。

2.3 聚类分析

为进一步验证羽或毛角蛋白的氨基酸分析是否可以应用于动物的分类及鉴别，对9种鹤、鹳羽角蛋白氨基酸含量差异进行了聚类分析。9种样本被聚为3类(图 3)，丹顶鹤、白枕鹤、白头鹤、灰鹤和黑颈鹤同属鹤形目鹤科鹤亚科鹤属聚类为一支，西非冠鹤和东非冠鹤同属鹤形目鹤科冠鹤亚科聚类为一支，白鹳、黑鹳属于鹳形目鹳科鹳属聚类为一支。对鹤科、鹳科与鹿科、熊科动物羽或毛角蛋白的氨基酸聚类结果则更为直观明显(图 4)。

根据聚类分析得出的遗传距离(表 3)计算得出：鹤科与鹳科之间欧氏遗传距离极差为1.036，鹤科与冠鹤亚科之间欧氏遗传距离极差为0.728，冠鹤亚科的2种鹤之间欧氏遗传距离为0.613，鹤属内欧氏遗传距离极差为0.472。随动物之间分类地位的接近，依据氨基酸含量差异计算出的遗传距离极差呈递减趋势。同属及同亚科内的动物遗传距离小，相似性强。不同亚科及科以上之间的动物遗传距离大，相似性差。聚类分析的结果与动物分类的结果是一致的。

3 讨论

现代生物技术的发展使建立野生动物分类系统的研究方法更加具有多样性，结合形态学和生态学表型特征，蛋白质电泳技术、RFLP和RAPD、核酸序列分析等技术已经广泛应用于分类学的研究(谢寿安等，2001)。由于这些技术精确性高，使得分析取样范围不断得到扩展。取样方法朝着简便可行，随机性强的方向发展，并以非损伤性作为取样的一项原则(陈珉等，2003)。

以动物羽和毛为试验材料从事野生动物的研究；不但可以增大样本的随机性和数量，而且简便易行，对动物无伤害。同时，馆藏标本也可以用来补充野外标本收集的不足，在一定程度上能解决对珍稀濒危动物的取样问题，有利于野生动物的保护。目前，以非损伤性取样方式获得的样本已广泛应用于野生动物的分子生物学研究领域，但是，由于羽毛样本中DNA含量甚微，存在严重的降解，且只限于羽髓(田秀华等，2005)，因而导致了样品DNA提取的困难；同时提取的DNA中还常伴有阻断物，给后续研究工作造成诸多的困难，因此，利用分子生物学方法对动物羽或毛进行分析存在一定的局限性(Taberlet et al., 1993; 1999)。

动物的羽和毛是其外观形态与组织结构的特征标志，其角蛋白是一类结构蛋白，构成相对保守稳定，受外界因素干扰较少。利用动物羽或毛角蛋白的氨基酸构成特征进行分析，其稳定性和可靠性相对较强，能定量地反映出所研究物种在分类系统中的相互关系。本课题组曾对15种鹿毛角蛋白的氨基酸组成特征分析，发现鹿类动物毛角蛋白的氨基酸组成有一特定的曲线，从曲线上的分布，可看出属间差异和种间的不同。本研究对鹤、鹳羽毛角蛋白氨基酸的组成分析表明，氨基酸组成分析曲线的差异程度随着目、科、属、种的下分而变小。通过对未知毛样的氨基酸组成分析曲线与相关的目、科、属、种的氨基酸分析曲线进行比较，可做出初步判定。此方法简便、快捷、精确、客观的特点为生物分类、识别与鉴定研究提供了一种新尝试。

当前，依靠动物形态学进行动物分类学研究仍然是分类方法的主体，但任何一种方法作为生物分类学研究的唯一手段都是不科学或不完善的。作为分类学研究的辅助手段，利用角蛋白的氨基酸构成特征进行动物分类学研究，还需要大量的科学研究加以验证和完善，才能使之成为一种切实可行的研究方法。