林业科学  2008, Vol. 44 Issue (2): 160-164   PDF    
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李潞滨, 胡陶, 唐征, 庄彩云, 刘振静, 杨凯, 彭镇华.
Li Lubin, Hu Tao, Tang Zheng, Zhuang Caiyun, Liu Zhenjing, Yang Kai, Peng Zhenhua.
我国部分兰属植物菌根真菌rDNA ITS序列分析
rDNA ITS Analysis of Mycorrhizal Fungi in Cymbidium Plants
林业科学, 2008, 44(2): 160-164.
Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(2): 160-164.

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收稿日期:2007-04-25

作者相关文章

李潞滨
胡陶
唐征
庄彩云
刘振静
杨凯
彭镇华

我国部分兰属植物菌根真菌rDNA ITS序列分析
李潞滨1, 胡陶1, 唐征2, 庄彩云1, 刘振静1, 杨凯2, 彭镇华1     
1. 中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 100091;
2. 北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室 北京 102206
关键词:兰属植物    菌根真菌    rDNA ITS分析    瘤菌根菌    胶膜菌属    
rDNA ITS Analysis of Mycorrhizal Fungi in Cymbidium Plants
Li Lubin1, Hu Tao1, Tang Zheng2, Zhuang Caiyun1, Liu Zhenjing1, Yang Kai2, Peng Zhenhua1     
1. Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of SAF Research Institute of Forestry, CAF Beijing 100091;
2. Key Laboratory of Agricultural New Technology and Application in Beijing, Beijing Agricultural College Beijing 102206
Abstract: rDNA internal transcribed spacer analysis (rDNA ITS) was used to study diversity of 12 representative mycorrhizal Rhizoctonia strains, which were isolated from Chinese orchids (Cymbidium) distributed in different sites and belonged to different ecologic types. The Blast results indicated that all these strains belonged to Epulorhiza or Tulasnella, which was fully consistent with identification as Epulorhiza with morphological method. Additionally, based on rDNA ITS sequence cluster analysis, dendrogram of Cymbidium mycorrhizal strains showed that the distributed environments and orchids species were two crucial factors that affected the specificity-relation between Chinese orchids (Cymbidium) symbiotic mycorrhizae and hosts.
Key words: Cymbidium    mycorrhizal-fungi    rDNA internal transcribed spacer analysis    Epulorhiza    Tulasnella    

兰科(Orchidaceae)植物俗称兰花,全世界约有700属20 000多种及大量变种,依其所属生态类型可分为地生兰、附生兰和腐生兰3类,作为一种重要的观赏花卉和药用植物资源,在花卉和天然药物产业上有着巨大的经济价值和利用潜力(罗毅波等, 2003)。兰科菌根真菌(orchid mycorrhizae)对于兰科植物具有重要意义,即兰科植物在自然生长状态下必须依赖与真菌建立共生关系才能完成正常生命活动(吴应祥, 1993),自Link首次发现兰科植物根内有内生真菌以来(Ressiek et al., 1847),对兰科菌根真菌及其与兰科植物间关系的研究也不断开展(Hadley et al., 1972; Currah et al., 1987; Currah et al., 1992; Zelmer et al., 1995; 范黎等, 2000; Taylor et al., 2004; 颜容等, 2006)。

由于形态学方法在已被普遍认同的兰科共生丝核菌属真菌的进一步细化分属鉴定中具有较大的局限性,近年国外越来越多地将多种分子标记技术运用于兰科菌根真菌鉴定的研究(Kristiansen et al., 2001; McKendrick et al., 2002; Selosse et al., 2002; Otero et al., 2002; Bougoure et al., 2005; Tham et al., 2001; Pope et al., 2001; Ming et al., 2003; Pereira et al., 2005a; 2005b; Andersen et al., 1992;Sen et al., 1998; McCormick et al., 2004),诸多此方面的工作表明了在兰科植物菌根真菌研究中广泛采用分子生物学技术手段的可行性和必然趋势。然而对于我国特有的、广泛分布的地生型兰属(Cymbidium)植物,却鲜见运用分子生物学技术手段对与其共生的菌根真菌进行系统发生学比较研究的报导(李潞滨, 1998)。本研究利用rDNA ITS技术对分离自4种不同地理分布和生态型中国兰属植物的12株共生瘤菌根菌(Epulorhiza)进行了遗传多样性分析研究,将rDNA ITS分析结果和形态学分类结果进行了比较,并在ITS序列分析基础上对中国兰属植物与菌根真菌间的专一性进行了初步探讨。

1 材料与方法 1.1 供试菌株材料

ITS分析的菌株材料为中国兰属植物12个共生菌根真菌菌株,由中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育实验室分离自4种兰属植物即春兰(Cymbidium goeringii)、蕙兰(C. fabery)、墨兰(C. sinense)、多花兰(C.floribundum),经形态学初步鉴定为属于广义兰科共生丝核菌(Orchid Rhizoctonia)的瘤菌根菌(表 1)。

表 1 ITS分析供试兰属植物及菌根真菌 Tab.1 Statistics of Cymbidium mycorrhizae for ITS analysis
1.2 菌株DNA提取

用PDA培养基培养分离得到的菌根真菌,28 ℃培养4 d,用接种针刮取一个培养皿培养的菌根真菌约0.2 g,加入1 mL DNA提取缓冲液(100 mmol·L-1 Tris, pH 8.5; 100 mmol·L-1 NaCl; 50 mmol·L-1 EDTA; 2% SDS),充分研磨,65 ℃水浴30 min;加入等体积苯酚:氯仿(1:1)轻轻混匀5 min;每分钟10 000转离心10 min,取上清液于一新离心管中;加入70%体积的异丙醇沉淀DNA,DNA用70%乙醇冲洗2次;将DNA溶解在500 mL TE缓冲液中,加入2 μL RNA酶,37 ℃ 30 min;加入等体积苯酚:氯仿(1:1)轻轻混匀;每分钟10 000转离心10 min,取上清液于一新离心管中;加入等体积氯仿,轻轻混匀;每分钟10 000转离心10 min,取上清液于一新离心管中;加入70%体积的无水乙醇沉淀DNA,DNA用70%乙醇冲洗2次;DNA溶解在1×TE缓冲液中,4 ℃备用(庄彩云等,2007)。

1.3 菌株rDNA ITS区段的PCR扩增、产物纯化及测序

兰花菌根真菌rDNA ITS区段PCR扩增和测序引物为ITS-P1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G),ITS-P2 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) (Gardes et al., 1993)。

PCR反应体系的组成为:100 mmol·L-1 Tris-HCl,50 mmol·L-1 KCl,1 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol·L-1 MgCl2,2.5 mmol·L-1 dNTPs,4 μmol·L-1引物,100 ng DNA模板。

PCR反应循环参数为:预变性96 ℃,2 min; 变性94 ℃,40 s; 退火60 ℃,40 s; 延伸72 ℃,45 s;进行35个反应循环;延伸72 ℃,5 min。

PCR产物经PCR产物试剂盒纯化后与pMD-18T(TaKaRa)载体连接,转化大肠杆菌DH-5α,选取阳性克隆由上海生工公司测序。

1.4 ITS序列排序及系统分析

ITS1和ITS2序列的起止范围参照GenBank中已有兰科植物菌根真菌的ITS范围确定。用DNAMAN软件对所获ITS序列进行系统分析,用最适全局排序选项进行成对同源性比对;Observed Divergency法构建系统树。

2 结果 2.1 rDNA ITS区段的PCR扩增及测序结果

用引物ITS-P1和ITS-P2扩增12个中国兰属植物菌根真菌菌株的rDNA ITS区段,获得约630 bp产物(图 1为部分菌株的rDNA ITS区段PCR产物电泳结果)。12个菌株的rDNA ITS区段PCR产物测序后获得ITS区段的全序列,ITS区域长度为628~642 bp,ITS1长度为170~186 bp,变异位点共68个,ITS2长度272~285 bp,变异位点64个。

图 1 菌株的rDNA ITS区段PCR产物电泳结果 Figure 1 Electrophoresis result of strains' rDNA ITS section PCR production
2.2 rDNA ITS序列的Blast比对结果

将分离所得12个中国兰属植物菌根真菌菌株的rDNA ITS序列在GenBank中进行了同源比对,所得结果见表 2

表 2 兰属植物菌根真菌rDNA ITS序列Blast比对结果 Tab.2 Blast results of Cymbidium mycorrhizae fungi rDNA ITS sequence
2.3 rDNA ITS序列聚类结果

12个中国兰属植物菌根真菌菌株的rDNA ITS序列聚类结果见图 2

图 2 兰属植物菌根真菌rDNA ITS序列聚类图 Figure 2 Dendrogram of Cymbidium mycorrhizae fungi based on rDNA ITS sequence cluster analysis
3 分析与讨论 3.1 rDNA ITS序列的Blast比对结果讨论

对分获菌株的rDNA ITS序列在GenBank中进行Blast同源性比对,结果显示本次研究中的12个兰属植物菌根真菌菌株与新加坡的Ming等(2003)、美国的Bougoure等(2005)McCormick等(2004)已报道的分离自兰属植物的瘤菌根菌属或胶膜菌属(Tulasnella)真菌之间的同源相似度达96%~99%(表 2),ITS序列分析与已有的相关研究结果相吻合。

对于被广泛认同的可与兰科共生的属于无性态半知菌范畴的广义丝核菌属菌根真菌,Moore(1989)、Currah等(1992)Andersen (1996)等以真菌桶孔隔膜超微结构特征等形态学鉴定标准已对其进行了细化分属,其中无性态的瘤菌根菌属真菌与有性态的胶膜菌属真菌被确认为同一真菌2种不同的存在形式。

本次所获12个菌株与GenBank中已报道的瘤菌根菌属或胶膜菌属真菌之间有着高度的同源性(96%~99%),Blast比对与形态学鉴定所获结论是一致的,以分子生物学和形态学2种手段展开鉴定研究的结果得到了充分的相互印证。以菌丝体桶孔隔膜超微结构特征等为依据形态学方法结合菌株rDNA ITS序列分析的分子生物学技术手段,可以大大提高开展兰科菌根真菌鉴定研究的科学性和准确性。

3.2 rDNA ITS序列聚类结果讨论

12个菌株的rDNA ITS区段PCR产物的测序表明,中国兰属植物菌根真菌之间的rDNAITS1、ITS2区段序列具有高度同源性的同时,也存在着较丰富的长度多态性信息,可以有效地通过兰属植物菌根真菌之间的rDNA ITS区段序列差异来鉴别兰属植物菌根真菌。

从本研究12个菌株的rDNA ITS序列聚类分析结果可见(图 2),从产于四川江津的墨兰分离出的菌株墨3 CS06-1、墨3 CS06-2和墨3 CS09聚在一起(EF393622、EF393623、EF393624序列间只有4个碱基出现差异)再与同一产地春兰分离的菌株春新25CG15X3聚在一起;从采集自云南腾冲的附生多花兰中分离的菌株C6 CH06X1-1、C6 CH06X1-2聚在一起(EF393629、EF393630序列间只有1个碱基出现差异);从采集自湖北罗田地生春兰分离出的菌株湖1 CG08-1和湖1 CG08-2聚在一起,(EF393627、EF393628序列间有4个碱基出现差异);从采集自河南确山的蕙兰中分离菌株间豫惠CH02X2-1和豫惠CH02X2-2聚在一起,序列间有12个碱基出现差异(EF393625,EF393626),这2菌株聚在一起后再与分离自同一采集地的春兰菌株豫春CG03聚在一起;这些菌株的聚类关系均与兰花寄主的地理分布和所属种相关,只有从产自四川江津的附生多花兰中分离的神CF07菌株与寄主地理分布、所属种的关系不一致。从不同产地兰花菌根真菌rDNA ITS序列多样性上分析,多样性呈现从南方到北方逐渐增大的趋势,说明兰花产地环境的复杂程度直接影响兰花菌根真菌的多样性。

这些结果说明兰花地理分布、所属种是影响中国兰属植物菌根真菌与兰花间专一性关系的关键性因素。

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