油茶(Camellia oleifera)是原产于我国的重要木本油料树种，广泛分布于我国南方，总面积达350万hm²，种仁含油率约为55%。所产茶油富含90%以上的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，还含有少量的亚麻酸等高价不饱和脂肪酸(胡芳名等，2006)，是易消化耐贮藏的优质食用植物油，其油质甚至一定程度上优于橄榄油。植物组织的不饱和脂肪酸组成很大程度上受到脂肪酸去饱和酶种类和数量的调控(戴晓峰等，2007)，而硬脂酰-ACP脱饱和酶(stearoyl-ACP desaturase，SAD)是不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶(Yukawa et al., 1996)，它催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP的反应，其主要作用是将硬脂酸脱氢后形成油酸(18:1)，因而直接决定了不饱和脂肪酸的总含量以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例(Kachroo et al., 2007)。目前，对油茶不饱和脂肪酸合成这一重要性状进行关键基因克隆及分子育种研究已成为油茶分子生物学的研究热点(雷小林等，2006；黄永芳等，2006)。然而，除了谭晓风等(2006)对油茶SAD(CoSAD)基因的EST序列进行了研究以外，还没有该基因的全长cDNA克隆的报道。本文在CoSAD的EST基础上，首次通过5′RACE技术获得油茶SAD基因的全长cDNA，并进行了较为深入的生物信息学分析。

1 材料与方法 1.1 材料

从湖南省林业科学研究院天际岭林场采集油茶优良无性系湘林1号(羊牯老1号)近成熟种子，洗净后于超低温冰箱中保存备用。油茶近成熟种子的cDNA文库为作者所在实验室构建(胡芳名等，2004)。

1.2 方法

1) 分子克隆操作  质粒提取、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选及酶切鉴定均按照张党权等(2006)进行。2)油茶种子总RNA提取  采用Total RNA Purification Kit(Invitrogen，USA)提取种子的总RNA。提取完毕取1 μL电泳检测。3)油茶SAD基因的5′RACE  在进行5′RACE之前，用无RNase的DNaseI处理油茶总RNA，以确保无DNA的污染。采用ClonTech公司的二步法RACE试剂盒进行5′RACE实验。取2~3 μL进行电泳检测。4)生物信息学分析  通过NCBI的GenBank对目的基因CoSAD的EST序列、cDNA序列和氨基酸序列进行Blast分析，采用生物学软件和生物学网站对CoSAD的cDNA序列和氨基酸序列进行生物信息学分析，包括基因序列特征、同源性比较、分子聚类、信号肽、疏水性及跨膜结构等。5)蛋白质同源建模及结构分析  将CoSAD送到SWISS-MODEL/PROMOD Ⅱ sever(Guex et al., 1997)进行同源建模，采用Verify3D(Luthy et al., 1992)对预测的理论三维结果进行立体化学和能量参数等方面的评估。蛋白质结构操作、分子电势表面和图形绘制等均采用Protein Explorer(Martz, 2002)进行。

2 结果与分析 2.1 油茶SAD基因的5′RACE扩增

谭晓风等(2006)对油茶SAD基因的EST进行了分析，获得了油茶种子的3条EST。为了获得油茶SAD基因的全长cDNA，先提取了油茶近成熟种子的总RNA，反转录成cDNA后，依据油茶SAD的EST设计特异引物，采用5′RACE技术扩增该基因cDNA的5′-末端，获得了与预期大小一致的特异DNA条带(图 1)。将该目的DNA条带回收、克隆后进行双向测序，然后与GenBank核酸数据库进行Blast分析，结果表明该DNA序列与已报道的其他物种SAD基因的cDNA序列具有极高的相似性，可确认所克隆的cDNA是油茶SAD基因的5′-端序列。

2.2 油茶SAD基因全长cDNA及氨基酸的序列特征分析

将所获得的cDNA与作者以前获得的CoSAD基因的EST进行序列拼接，即获得油茶SAD基因的全长cDNA序列，该序列全长为1 579 bp，CDS为1 191 bp(156~1 346)，编码的蛋白质由396个氨基酸残基组成(图 2)。该cDNA的5′UTR和3′UTR较长，分别为155 bp和232 bp，表明所克隆的CoSAD基因的cDNA是一个完整度较好的全长cDNA。

2.3 油茶SAD基因的生物信息学分析

将油茶SAD的氨基酸序列与GenBank中已注册的其他植物SAD的对应序列进行了Blastp分析，结果表明CoSAD与其他物种具有较高的同源性，特别是与油料植物具有很高的同源性，而与非油料植物同源性相对较低。

对油茶SAD与主要的油料植物(12种)SAD进行了相似性(similarity)和差异性(diversity)分析，结果表明：油茶SAD与麻疯树(Jatropha curcas)SAD(JcSAD)和蓖麻(Ricinus communis)SAD(RcSAD)的相似性较高(91%)，差异性较低(6%)；而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)SAD(AtSAD)和芥菜(Brassica juncea)SAD(BjSAD)的相似性较低(78%)，差异性较高(10%)；根据与其他8种油料植物SAD的相似性和差异性，其同源性由高到低依次为：芝麻(Sesamum indicum)SAD(SiSAD)、向日葵(Helianthus annuus)SAD(HaSAD)、油橄榄(Olea europaea)SAD(OeSAD)、花生(Arachis hypogaea)SAD(AhSAD)、大豆(Glycine max)SAD(GmSAD)、油棕(Elaeis guineensis)SAD(EgSAD)、亚麻(Linum usitatissimum)SAD(LuSAD)、油菜(Brassica napus)SAD(BnSAD)(表 1)。

对油茶SAD与这些主要油料植物的SAD进行了氨基酸序列比对分析，结果表明，所有的SAD的核心区段几乎完全相同，仅在起始密码子和终止密码子附近有较大的差异(图 3)。对油茶CoSAD进行在线的信号肽、疏水性及跨膜结构分析，结果表明，油茶SAD不存在明显的信号肽特征，应不具有细胞内定位的功能(图略)；同时，油茶SAD也不存在明显的跨膜结构特征，整体上具有很强的亲水性(图 4)。

将油茶SAD与上述12种主要油料植物的SAD进行了氨基酸序列水平上的聚类分析(图 5)，结果表明，油茶SAD与麻疯树、蓖麻、芝麻的亲缘关系更近，并与花生、大豆、油棕、向日葵聚为一大类；芥菜、油菜、拟南芥、亚麻聚为一大类，而油橄榄单独为一类。这一聚类结果表明，油茶SAD与木本油料植物或不饱和脂肪酸含量较高的植物在进化上具有较高的保守性。

通过同源建模法获得了油茶SAD的理论三维结构(图 6)，含有11个α-螺旋，其中9个α-螺旋形成了一个反平行螺旋束，该螺旋束上的4个α-螺旋与Fe²⁺共同形成了油茶SAD的活性中心，更有利于将硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP，从而获得高含量的油酸。

3 结论与讨论

在作者以前构建的油茶cDNA文库和EST文库的基础上，通过5′RACE技术获得了油茶SAD基因的全长cDNA，含1 579 bp，编码396个氨基酸，5′UTR和3′UTR分别为155 bp和232 bp，表明该cDNA是一个完整度较好的全长cDNA。

植物SAD催化结合于ACP的特定长链饱和脂肪酸在特定位置形成双键，是植物典型不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和，因此直接调节了膜脂与贮脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例(李国和等，2007)。由于油茶种子中的不饱和脂肪酸含量极高，特别是油酸含量高达80%以上，表明油茶SAD的活性较高。对油茶SAD基因的cDNA序列进行了较系统的生物信息学分析，包括序列特征分析、多序列比对、相似性与同源性分析、分子聚类、蛋白质理化特性以及结构预测与特征分析，结果表明油茶SAD基因在进化上较为保守，与其他植物SAD的相似性较高，其活性中心应比普通植物的SAD更有利于将饱和脂肪酸转换成油酸。因而，油茶SAD基因应具有更大的应用价值与范围(吴雪辉等，2005；吴小娟等，2006)。

在油茶cDNA文库和EST文库中，作者已确认了266种功能已知的基因，除与油脂合成相关的基因外，还包括与胚胎发育和种子成熟相关的基因、与基因表达相关的基因、油体蛋白基因、抗逆性基因，以及其他一些重要性状基因(胡芳名等，2005；谭晓风等，2005；张党权等，2007)；同时，还获得了1 216个功能未知的新基因(谭晓风等，2007)。这些基因大多数是不完整的cDNA序列，特别是缺失了关键的5′端序列，因而必须通过RACE方法获得全长cDNA后才能直接利用。本文的研究结果为油茶SAD基因的开发应用及其他油脂植物的遗传改良奠定了理论和技术基础，为油茶其他重要性状基因的全长cDNA克隆提供了借鉴。