林业科学  2008, Vol. 44 Issue (2): 116-123   PDF    
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池玉杰, 闫洪波.
Chi Yujie, Yan Hongbo.
6种白腐菌腐朽前后的山杨木材酚酸种类和含量变化的高效液相色谱分析
HPLC Analysis on Different Phenolic Acids and Their Contents of David Poplar Wood Degraded by 6 Species of Wood White-Rot Fungi
林业科学, 2008, 44(2): 116-123.
Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(2): 116-123.

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收稿日期:2006-08-11

作者相关文章

池玉杰
闫洪波

6种白腐菌腐朽前后的山杨木材酚酸种类和含量变化的高效液相色谱分析
池玉杰, 闫洪波     
东北林业大学林学院 哈尔滨 150040
摘要: 研究阔叶树上的6种木材白腐菌火木层孔菌、粗毛盖菌、偏肿拟栓菌、三色革裥菌、冬拟多孔菌和血红密孔菌对山杨材腐朽前后木材中游离酚酸种类和含量的变化情况。结果表明:受6种白腐菌腐朽后的山杨木材中酚酸的种类和含量各不相同,在山杨材被分解120 d后,偏肿拟栓菌、三色革裥菌、血红密孔菌和冬拟多孔菌的9种游离酚酸总含量远大于粗毛盖菌和火木层孔菌的9种游离酚酸总含量,表明前4种对木质素分解能力较强的菌种获得了较高含量的酚酸;但从9种游离酚酸总的含量上看,与各菌种对木材和木质素的分解百分率不尽相同,初步分析的原因表明在木质素被分解的过程中除了有这9种游离酚酸产生以外,可能还会产生其他的游离酚酸以及苯环二聚体、三聚体和各种寡聚体以及杂环的形式,所有这些苯环结构总体造成了对木质素分解百分率的差异。对9种酚酸进行分析测试,只构成对木质素分解的一部分,不足以用来解释对木质素的全部分解能力,其他的酚酸和游离酚酸以外的苯环结构还有待进一步研究分析测试;从各种游离酚酸单个含量上看,各种白腐菌的种类和含量都各不相同,表明不同白腐菌对同一木质纤维基质的分解途径、中间降解产物各不相同。另外,未腐朽的木材中本身就含有一些微量的酚酸成分,这些酚酸在生物分解过程中会降解和转化成其他成分,是否有可能转化成其他种类的酚酸还有待进一步证明。
关键词:木材白腐菌    酚酸    高效液相色谱分析    
HPLC Analysis on Different Phenolic Acids and Their Contents of David Poplar Wood Degraded by 6 Species of Wood White-Rot Fungi
Chi Yujie, Yan Hongbo     
College of Forestry, Northeast Forestry University Harbin 150040
Abstract: Because different wood-rotting fungi have different wood degrading mechanisms to the same ligneous substrate, the composition and contents of phenolic acids of the same wood species degraded by different wood-rotting fungi can exhibit different changes. In order to get more further study on wood biodegrading mechanism with david poplar wood degraded by wood white-rot fungi, different phenolic acids and their contents of david poplar wood degraded by 6 species of wood white-rot fungi living on broad-leaf trees, i.e. Funalia gallica, Lenzites tricolor, Phellinus igniarius, Polyporellus brumalis, Pseudotrametes gibbosa, and Pycnoporus sanguineus were analyzed. HPLC method was used to measure the contents of dissociated phenolic acids of primitive wood sample and wood samples degraded by 6 species of fungi on 120 d, respectively, HPLC chromatograms of different samples were gained. A little powders shaved from the very surface of primitive wood sample and wood samples degraded by 6 species of fungi on 120 d were milled under dryness, vibrated by ultrasonic in petroleum ether and circumfluenced in methanol, then various phenolic acids in the same sample were separated from higher polarity to lower polarity in a reverse phenyl column, mg contents of various phenolic acids in each of 100 g sample could be calculated by the chromatogram area of various dissociated phenolic acids in different samples. Results showed that the kinds and contents of phenolic acids in primitive david poplar wood and david poplar wood degraded by 6 species of wood white-rot fungi on 120 d were different, the total contents of 9 kinds of dissociated phenolic acids in wood samples degraded by Pseudotrametes gibbosa, Lenzites tricolor, Pycnoporus sanguineus, and Polyporellus brumalis were higher than those degraded by Funalia gallica and Phellinus igniarius, indicating that the former 4 white-rot fungi with higher wood degrading ability gained higher contents of phenolic acids. But the total content of 9 kinds of dissociated phenolic acids in one sample was not completely same with wood and lignin degrading percent, suggesting that other dissociated phenolic acids or aromatic ring dimmer, trimer oligomer and heterocyclic compounds might be produced besides 9 kinds of dissociated phenolic acids tested, all of the aromatic compounds contributed to lignin degrading percent, 9 kinds of dissociated phenolic acids tested only was not enough to explain the lignin degrading ability, all other aromatic compounds except 9 kinds of dissociated phenolic acids should also be tested later. The kind and content of phenolic acids tested of each white-rot fungus were different from those of each other, indicating that different white-rot fungi had different degrading pathway and intermediate degrading compounds to the same ligneous substrate. In addition, a little phenolic acids were in primitive wood sample which could be degradated and transformed into other kinds of compounds in the process of biodegradation, it would be further determined whether the primitive intrinsic phenolic acids could be transformed into other kinds of phenolic acids.
Key words: wood white-rot fungi    phenolic acids    HPLC analysis    

天然酚酸类化合物在植物中分布广泛,但是一般成分复杂、含量低,相互间分离比较困难。对于酚酸类化合物的测定方法有多种,如光度法、毛细管电泳法、电化学分析法、流动注射分析法和色谱法等,而色谱法又有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)等(王晓霞等,2003)。气相色谱普遍用于酚类化合物的检测,但是气相色谱一般需要制备衍生化的样品,耗时,而且在衍生化过程中常有化学反应产生,因此近年来HPLC方法越来越多地应用于极性化合物如酚酸的检测中(Liu et al., 2006; Torre-Carbot et al., 2006; Vanbeneden et al., 2006)。HPLC采用高灵敏度的检测器,最小检出量可达到10-9~10-12g·L-1(汪茂田等,2004),适于痕量分析,能够比较好地分析不同植物试样中的有机酸、酚酸等各种微量成分的含量(Miao et al., 2003江和源等,2004)。在酚酸类化合物的HPLC检测中,不同的研究者采用了不同的色谱工作条件,所用参数主要包括色谱柱的选择、流动相的组成与等度和梯度洗脱、酸度调节、流速、柱温、检测器等(Marko-Varga et al., 1992; 刘江云等,2002)。酚酸成分的常规HPLC检测多数采用C18柱、包括弱酸在内的二元流动相系统——极性的乙腈或甲醇水溶液、紫外(UV)和二极阵列检测器(DAD)(Govindarajan et al., 2007; Zhang et al., 2007),如Hoffmann等(2007)采用C18柱分离、CH3OH-H2O系统梯度洗脱、DAD检测,在柱温15 ℃、流速0.5 mL·min-1的条件下,建立了生物体燃烧后的颗粒中21种酚酸和酚类化合物的同时定性定量方法;倪学文(2004)采用C18柱分离、90%CH3OH-H2O系统等度洗脱、紫外检测器(λ=310nm)和DAD检测,在柱温30 ℃、流速0.7 mL·min-1的条件下,对银杏酚酸进行了定性定量分析。通过优化色谱参数条件,可以获得较高的分离度,如Križman等(2007)对茴香中的酚类化合物进行了HPLC-MS分析,发现样品注射体积、柱温对于样品分离的选择性和分离度至关重要,通过参数的优化,可以缩短操作运行的时间。

近年来,人们也常借助于各种色谱分析等手段研究木材的超分子结构、化学性质等,由于木材中的木质素是由苯丙烷单元组成的高聚物,在木材生物降解过程中苯丙烷聚合体的分解会产生一些酚酸;另外,一般木材本身也都会有一些微量的酚酸存在。那么采用高效液相色谱法来测定不同木材试样中的酚酸种类和含量应该是一种行之有效的方法。作者曾对木材腐朽菌的木材分解能力、木材白腐菌对山杨(Populus davidiana)材木质素的分解能力进行过研究与报道(池玉杰,2001池玉杰等,2002),并对受6种木材白腐菌腐朽后的山杨木材和木质素官能团变化情况进行了红外光谱分析(池玉杰,2005);秦特夫(1999)曾用红外光谱、超导核磁共振波谱(1HNMR)和液相波谱法(HPLC)等对杉木(Cunninghamia lanceolata)、“三北”一号杨(Populus nigra×P. simonii)磨木木质素官能团的特征进行过分析,而受木材白腐菌腐朽后的木材和木质素酚酸种类和含量的变化情况在国内还未见报道。本文用高效液相色谱法分析了6种白腐菌腐朽前后的山杨木材酚酸种类和含量的变化情况,目的是探索木材受白腐菌腐朽后酚酸和木质素成分的变化情况和中间降解产物,从而进一步分析腐朽的途径、程度等,以作为木材白腐菌对山杨材木材和木质素生物降解机制的进一步研究。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种来源

6种木材白腐菌采自东北林区,经组织分离获得菌种,它们是火木层孔菌(Phellinus igniarius)、粗毛盖菌(Funalia gallica)、偏肿拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)、三色革裥菌(Lenzites tricolor)、冬拟多孔菌(Polyporellus brumalis)和血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)。

1.1.2 山杨未腐朽木材样品来源

山杨木材样品为2000年11月29日在东北林业大学帽儿山实验林场新垦事业区7林班采的20~30年生小径级未腐朽山杨木材,晾干到一定程度后,用电锯削成2 cm×2 cm×1 cm小片,成为山杨未腐朽木材样品。

1.1.3 高效液相色谱分析用的仪器与试剂

仪器:Waters 244型高效液相色谱仪(产自美国),TL9000(金羊)色谱工作站。试剂:没食子酸、原儿茶酸、邻苯二酚、对羟基苯甲酸、咖啡酸、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸,以上9种酚酸是用于酚酸标准样品制备的试剂,均为色谱纯(sigma);甲醇:优级纯,经0.5 μm滤膜过滤;水:重蒸,经0.45 μm滤膜过滤;磷酸:优级纯;石油醚:分析纯。

1.2 方法 1.2.1 山杨腐朽木材样品的制备

清除山杨未腐朽木材样品上面的木屑,取一定数量放入温度为105 ℃烘箱中烘至恒重,然后用多层纱布包好,在高压灭菌锅中灭菌(0.12 MPa下灭菌30 min),使试样含水率达到40%~60%。在无菌条件下即刻将这样的木片放入接种10 d长满菌丝的平板培养基内,然后将培养皿放入25 ℃恒温箱中培养使木片受菌侵染,期间用白瓷盘加水放入温箱中使温箱内保持一定湿度。对于每一菌种,山杨材木片样品分别被腐朽120 d后,取出附带菌丝体的小块,用毛刷和水冲洗干净,除去表面菌丝,然后放入105 ℃烘箱中烘干至恒重,装入干燥器中待用(GB/T 13942.1-92)。

1.2.2 高效液相色谱分析时的色谱条件

柱:μ-Bonkapak Phenyl(0.4 cm × 30 cm);流动相:35% CH3OH-65% H2O (用H3PO4调pH = 4.5);流速:1.0 mL·min-1;检测器:UV254 nm × 0.1AUFS。

1.2.3 标准溶液的配制

精确称取上述9种标准酚酸样品试剂各2 mg于25 mL容量瓶中,用流动相溶解定容,摇匀备用。

1.2.4 样品溶液的制备

对于山杨未腐朽材和受每一种白腐菌腐朽后的腐朽材木材试样,在105 ℃烘箱中烘干至恒重后,分别用刀片刮取或者用砂纸磨取表层木粉和表层腐朽变色的部分,得到的木粉过40目筛。精确称取过40目筛的木材干粉3 g于100 mL的锥形瓶中,加50 mL石油醚,在超声波中振荡30 min,放置过夜,滤去石油醚,残渣晾干转入150 mL圆底烧瓶中,加40%~50%甲醇水溶液50 mL加热回流1 h,过滤,滤液浓缩后用甲醇定容至25 mL。取Waters公司Sep-Pak C18小柱一支,用5 mL甲醇冲洗活化,再用5 mL水冲洗。吸取5 mL样品提取液通过小柱,弃去最初洗出液1 mL,再收集2 mL洗出液待测定。

1.2.5 高效液相色谱分析

取5 μL混合标准溶液进行分析,可得到标准溶液的色谱图,重复进样3次,计算出标样中各组分峰面积平均值。在同一色谱条件下,取样品溶液10 μL进行分析,可得到样品溶液的色谱图,重复进样3次,计算出样品溶液中各相应峰面积平均值。通过下述公式可计算出100 g样品中各组分的毫克含量C值:

式中:C为100 g样品中各组分含量(mg);C1为标样进样体积中各组分含量(μg);C2为样品称样量(g);V1为样品进样体积(μL);V2为样品定容体积(mL);A1为标样中各组分峰面积平均值;A2为样品中各相应峰面积平均值。

2 结果与讨论

色谱工作站根据设定的积分参数(斜率、半峰宽、最小峰高和最小峰面积)和基线的设定,通过计算直接打印出色谱图、不同组分的保留时间、峰面积和峰高,通过对比样品峰和标样峰的保留时间,确定样品中的酚酸组分种类。混合标准溶液9种酚酸的高效液相色谱图见图 1,山杨未腐朽材和受6种白腐菌腐朽120 d后的木材试样的高效液相色谱图见图 2~8,计算出的酚酸含量见表 1

图 1 9种酚酸标样的高效液相色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram of 9 kinds of phenolic acids 没食子酸、原儿茶酸、邻苯二酚、对羟基苯甲酸、咖啡酸、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸Gallic acid; Protocatechuric acid; Catechol; Ο-hydroxybenzoic acid; Caffeic acid; Chlorogenic acid; Coumaric acid; Ferulic acid; Benzoic acid.下同。The same below.
表 1 山杨材腐朽前后的酚酸含量 Tab.1 Contents of phenolic acids of P.davidiana before and after degraded by different wood-rotting fungi
图 2 山杨原样的高效液相色谱图 Figure 2 HPLC chromatogram of primitive wood sample
图 3 受火木层孔菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 3 HPLC chromatogram of wood sample degraded by P. igniarius on 120 d
图 4 受粗毛盖菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 4 HPLC chromatogram of wood sample degraded by F.gallica on 120 d
图 5 受偏肿拟栓菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 5 HPLC chromatogram of wood sample degraded by P. gibbosa on 120 d
图 6 受三色革裥菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 6 HPLC chromatogram of wood sample degraded by L. tricolor on 120 d
图 7 冬拟多孔菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 7 HPLC chromatogram of wood sample degraded by P. brumalis on 120 d
图 8 受血红密孔菌降解120 d的高效液相色谱图 Figure 8 HPLC chromatogram of wood sample degraded by P. sanguineus on 120 d
表 1 山杨材腐朽前后的酚酸含量 Tab.1 Contents of phenolic acids of P.davidiana before and after degraded by different wood-rotting fungi
2.1 酚酸的结构与极性不同,保留时间不同

羟基酸中羟基直接连接在芳香酸上的有机化合物称为酚酸,因此酚酸具有酚和羧酸的一般性质。由于酚酸带有羟基和羧基,属于极性化合物,可用甲醇等极性溶剂从试样中提取出来。待测样品经石油醚脱脂后,经超声波振荡会游离出酚酸等多种有机化合物,当酚酸经甲醇回流抽提再加以净化后,可用反相苯基柱分配色谱法分离并定量。因为各种酚酸的结构不同,分子极性不同,当流动相偏酸性时,各种酚酸在分馏时的保留时间不同,能够按照极性由大到小依次被洗脱出来,因此高效液相色谱仪可以定量分析待测样品溶液中各种酚酸的含量。对于极性化合物流动相可以选择甲醇与水的混合溶剂,由于酚酸属于强极性化合物,可选择较低浓度的甲醇水溶液,本项试验中选用35%的甲醇水溶液。在本项试验中的色谱条件下,在9种酚酸中,由于没食子酸具有3个游离酚羟基和1个羧基,极性最强,所以最先分离出来,其次是具有2个游离酚羟基和1个羧基的原儿茶酸,接下来是具有2个游离酚羟基的邻苯二酚、1个游离酚羟基和1个羧基的对羟基苯甲酸、2个游离酚羟基和丙烯基的咖啡酸、咖啡酸与奎宁酸缩合成的绿原酸、1个游离酚羟基和丙烯基的香豆酸、1个游离酚羟基和1个甲氧基和丙烯基的阿魏酸、1个羧基的苯甲酸,这9种酚酸的保留时间分别是没食子酸6 min、原儿茶酸9 min、邻苯二酚12.8 min、对羟基苯甲酸14.6 min、咖啡酸15 min、绿原酸16.5 min、香豆酸27.3 min、阿魏酸29.5 min、苯甲酸33.6 min。

2.2 酚酸结构的产生表明部分木质素结构的侧链已经断裂

同一种木质纤维基质受不同的木材腐朽菌分解后,酚酸种类的来源可以有如下的方式:1)木质素结构在分解过程中可以产生不同种类的酚酸;2)未腐朽的木材中本身就含有一些微量的酚酸成分,如本项试验中每100 g山杨材试样原有的酚酸包括邻苯二酚15.17 mg、绿原酸2.88 mg、原儿茶酸0.83 mg、没食子酸0.41 mg、咖啡酸0.29 mg,这些酚酸有可能在生物分解过程中被分解成小分子的物质,但也有可能有一些酚酸残留下来,已经经过120 d分解的山杨材经过这种形式残留的酚酸应该是极其微量的。因此木质素结构的分解是腐朽的木材中酚酸的主要来源。山杨材受6种白腐菌分解120 d后的红外光谱的分析结果表明:受6种白腐菌降解120 d后的木片中的木质素都在一定程度上被降解,但对木质素结构的降解主要存在于侧链上,苯环骨架变化不明显,木质素苯环间的羰基、CH2结构、紫丁香基和愈创木基等侧链已部分被降解(池玉杰,2005)。本项试验中受6种白腐菌分解120 d后的山杨材酚酸种类和含量的结果表明:酚酸结构的产生明确地说明了部分木质素结构的侧链已经断裂,这与红外光谱的分析结果相同。

2.3 6种白腐菌腐朽后的山杨木材中酚酸的种类和含量各不相同

表 1可以看出,从各种游离酚酸的单个含量上看,受6种白腐菌腐朽120 d后的山杨木材中酚酸的种类和含量各不相同,例如火木层孔菌分解后的木材含有没食子酸、原儿茶酸、邻苯二酚、咖啡酸、绿原酸和阿魏酸,而血红密孔菌分解后的木材含有原儿茶酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸和苯甲酸,表明由于不同木腐菌的生理特性不同,所分泌的酶及酶的活性各不相同,因此不同的木腐菌所分解木材的各种成分及相对速度就各不相同,不同的白腐菌对于相同的木质纤维基质存在着不同的分解机制,具有不同的中间代谢产物和途径,导致腐朽前后的酚酸种类和含量会出现不同的变化。

从色谱图可以看出,受6种白腐菌腐朽120 d后的山杨木材各样品的色谱图基线漂移都比较严重,分析原因可能是木材样品在石油醚中经过超声波振荡、50%的甲醇加热回流后,除了有各种微量的酚酸被提取出外,还有其他强保留的物质,即高容量因子的物质以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。由于基线漂移,导致不同的酚酸种类在不同的基线水平上表现峰高和计算峰面积,造成准确性下降,对于定量分析的结果会有一定的影响。对于这种状况引起的基线漂移处理方法,应在今后的腐朽木材试样的HPLC分析中,在进样之间或在色谱仪处理试样与分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子,使杂质迅速被洗脱出、脱离固定相;或使用其他的保护柱进行测试,使杂质物质不易被固定相吸附和在固定相中存留,从而降低基线漂移的程度。这一点要在今后的腐朽木材试样的HPLC分析中进一步测试和注意,并尽量避免。

2.4 木质素分解后的中间产物还会有其他形式

由以前的研究可知,冬拟多孔菌、偏肿拟栓菌、粗毛盖菌、血红密孔菌和三色革裥菌是5种对青杨材分解能力较强的白腐菌,而火木层孔菌对青杨材的分解能力很弱;对山杨木材的分解百分率由大到小依次为血红密孔菌、粗毛盖菌、三色革裥菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌和火木层孔菌,对山杨材木质素的分解百分率依次为血红密孔菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、偏肿拟栓菌、粗毛盖菌和火木层孔菌(池玉杰,2001池玉杰等,2002)。本项试验的结果表明:山杨材受6种木材白腐菌分解120 d后,偏肿拟栓菌、三色革裥菌、血红密孔菌和冬拟多孔菌的9种游离酚酸总含量(分别为136.43、111.58、62.14和46.33 mg)远大于粗毛盖菌和火木层孔菌的9种游离酚酸总含量(分别为3.98和6.89 mg),表明前4种对木质素分解能力较强的菌种获得了较高含量的酚酸,而后2种的9种游离酚酸总含量比山杨材原样还低,说明木质素的分解程度很低,现有的酚酸是否由木材中本身含有的微量酚酸转化而来还有待进一步证明;从9种游离酚酸总的含量上看,与各菌种对木材中木质素的分解百分率不尽相同,初步分析在木质素被分解的过程中除了有这9种游离酚酸产生以外,可能还会产生其他的游离酚酸以及苯环二聚体、三聚体和各种寡聚体以及杂环的形式,所有这些苯环结构总体造成了对木质素分解百分率的差异。本项试验中由于酚酸标样有限,只测定了9种酚酸的含量,这不能满足对木质素分解百分率的分析精度要求。因为仅对这9种酚酸进行分析测试,只构成对木质素分解的一部分,不足以用来解释对木质素的全部分解能力,其他的酚酸如丁香酸、水杨酸等和除游离酚酸以外的苯环结构还有待进一步分析测试与研究。

2.5 流动相的选择

在酚酸类化合物的HPLC分析中,由于不同的酚酸极性大小不同,流动相的选择一般为甲醇水溶液或乙腈水溶液,常用乙酸等酸性抑制剂调节pH值,并以系统梯度洗脱为好。但是在本项试验中使用的是苯基聚合柱,这种色谱柱因具有疏水性常用于反相色谱,但在不同的溶剂中溶胀不同,所以一般用等度洗脱。从试验结果来看,虽然测定的各酚酸之间极性有差别,但是都属于极性较强或强极性的化合物,流动相采用35%的甲醇水溶液等度洗脱,也能达到使各酚酸有效分离的目的,效果也较好。

3 结论

木材中本身含有一些微量的酚酸成分,而木材中的木质素成分在生物分解的过程中,也会产生一些酚酸。受6种白腐菌腐朽120 d后的山杨木材中酚酸结构的产生表明,部分木质素结构的侧链已经断裂。

由于不同白腐菌对同一木质纤维基质存在着不同的分解机制,分解途径和中间降解产物各不相同。因此同一木质纤维基质受到不同的白腐菌分解后,腐朽前后的酚酸种类和含量会出现不同的变化。

木质素结构在生物分解的过程中可以产生多种酚酸结构,还可能产生苯环二聚体、三聚体和各种寡聚体及杂环的形式,所有这些苯环结构总体造成了不同白腐菌对木质素分解百分率的差异。

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