马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)是浙江省重要的森林害虫, 也是我国南方林区松林主要食叶害虫之一，在浙江往往呈周期性发生并猖獗成灾, 造成严重的经济损失和生态环境的破坏。近年来，随着经济的发展，人们生活水平的提高，广大农民对薪柴的需求量日趋减少，封山育林技术在浙江全省得到广泛推广和应用，很多地区的森林植被已有十多年未砍伐，森林生长环境明显改善，加快了森林的自然演替过程。上述情况主要表现为林分郁闭度增大，植被种类增加，阔叶树种得到良好生长，森林的生态功能日趋复杂多样，林相单纯、遗传单一、生态功能简单的人工林已逐渐演化为天然林，林内温湿度条件相对封育前有明显改善，低温高湿环境初步形成，不利于松毛虫生长发育，森林抗御病虫害能力大大增强。另一方面，封山育林后，人为破坏减轻，林内天敌的种类和数量明显增加，对松毛虫的发生起到了抑制作用，同时各种生物、物理防治等综合治理方法的广泛应用，使得浙江省已连续多年未发生虫灾。

松毛虫生物学特性、种群动态、防治和管理等方面已有较为深入的研究(柴希民，1995；陈昌洁，1990；萧刚柔，1992；Zhang et al., 2003)，然而关于松毛虫属某些种类的亲缘关系或分类地位的确定历史上争议颇多，前人分别从形态学、遗传学及化学生态学入手，研究了我国主要松毛虫中的2种或几种松毛虫间的亲缘关系(蔡邦华等，1965；赵清山等，1999；孔祥波等，2001)，尽管如此，到目前仍然没有形成一致的看法。另外，由于松毛虫成虫有很强的迁移扩散能力，一般为飞行距离5~10km，不同的松毛虫种间可形成天然杂交种，造成防治困难(赵清山等，1999)。同时，迁飞造成的基因流动使松毛虫地理种群的遗传结构发生变异，迁飞的发生还将导致不同生态型的基因交流，增加迁入地内的遗传变异性，从而影响种群动态。然而，对松毛虫各地理种群基因交流频度、变异模式以及它们对害虫区域性灾变的影响目前少见报道。

ISSR(inter-simple seqence repeats，简单重复序列中间区域)是Lieckfeldt等(1993)创建的一种新型微卫星类分子标记技术。在真核生物的基因组中广泛存在着的以1~6个碱基为1个单位呈串联状重复排列的序列，称为简单重复序列(simple seqence repeats，SSR)，又称为微卫星(microsatellite)序列。ISSR分子标记技术就是利用简单重复序列设计引物，即引物主要由1~4个碱基组成的重复序列，通常在引物的3'端或5'端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因组DNA中的SSR的3'或5'端结合。与其他的分子标记技术相比，ISSR标记技术具有操作简单、稳定、可重复性好及多态性高等优点(Nagaraju et al., 2001)，在遗传性状相关标记的选择、品系鉴定、遗传多样性分析和遗传育种等领域具有广阔的前景。本研究利ISSR方法对采集于浙江省5个地区的马尾松毛虫，进行了全基因组水平的DNA多态性分析，为研究松毛虫迁飞模型和适应性，制定经济、及时、行之有效的害虫综合管理措施提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

2004年5月，从浙江省永康、丽水、杭州、洞头及苍南等地野外采集马尾松毛虫蛹，实验室传代饲养扩大种群。实验室条件下，以消毒后的新鲜马尾松松针饲养马尾松毛虫幼虫至化蛹(何丽华等，2005)，饲养温度27 ℃，光周期为D:L=16:8。每个种群各取样15头个体用于基因组DNA的提取。试验中所用的Taq酶、dNTPs购自TaKaRa公司。

1.2 基因组DNA的提取和纯化

每个种群15头个体分别提取总DNA。解剖大龄松毛虫幼虫的丝腺，洗净后在预冷的研钵中加液氮快速研磨成为粉末状，加抽提缓冲液(10 mmol·L^-1 Tris-Cl pH8.0; 0.1 mol·L^-1 EDTA pH8.0; 0.5%SDS)，混匀后转入离心管中，加蛋白酶K至终浓度100 μg·mL^-1，56℃水浴保温3~5 h后离心，上清用平衡酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿各抽提1次，上清用2倍体积冰无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗涤2次，加TE溶解；加RNA酶H至终浓度50μg·mL^-1，37 ℃保温2 h以消化RNA，再用平衡酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)氯仿各抽提1次后，用2倍体积冰无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗涤2次，加TE溶解，电泳检查DNA质量，经分光光度计(Beckman DU640)检测浓度和纯度。每种群从中挑选出纯度高的10个个体组成基因池，用于ISSR-PCR扩增。

1.3 ISSR扩增反应

参照文献(侯成香等, 2005)，委托上海生工生物工程有限公司合成19个ISSR引物，优化ISSR-PCR的反应条件，筛选扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应。

1.4 数据分析

同一标记在不同品种中扩增, 有带存在记为“1"，没有同样大小的带则记为“0"，用Nei (1978)的方法计算出各品种间的遗传距离，然后用UPGMA方法进行聚类分析。采用Popgene程序version 1.31完成数据分析。

2 结果与分析 2.1 引物的筛选反应条件的优化

虽然ISSR引物具有通用性，一套引物可用于不同的物种，但是由于物种间基因组的组成有差异，不是每个引物都适合于所有物种，而且不同引物所要求的反应条件也不同，因此对引物的筛选和反应条件的优化是非常必要的。一般的原则是所研究的基因组DNA越复杂，重复序列的密度越高，对引物的专一性要求就越高，运行PCR的条件也就越严格。

由于ISSR-PCR与RAPD-PCR很相似，模板浓度、引物浓度、镁离子浓度以及退火温度等可明显地造成扩增带型的变化。本研究参照文献(侯成香等, 2005)，委托上海生工生物工程有限公司合成19个ISSR引物(表 1)。在确定模板浓度、引物浓度、镁离子浓度后，主要对退火温度进行优化。

ISSR-PCR扩增反应在Eppdorf公司的梯度PCR仪上进行，反应体系为：50 μL PCR反应液中，模板约40 ng，0.3 U Taq酶，5 μL的10×Buffer (200 mmol·L^-1 Tris-HCl，100 mmol·L^-1 (NH₄)₂SO₄，100 mmol·L^-1 KCl，1% Triton X-100，20 mmol·L^-1 MgCl₂)，4种dNTP各0.25 mmol·L^-1，6 pmol的引物。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环，循环结束后72 ℃延伸5 min。

由于引物退火温度的计算有多种方法，得出的T_m值也不尽相同(表 1)。在预试验中，分别以不同公式计算的T_m值为复性温度，调查PCR扩增产物的专一性和分辨率。从图 1可知，在低T_m温度(Oligo Calculator T_m)下复性，PCR扩增条带较多，但影子条带增多，重复性、分辨率较差(图 1A)，在高T_m (Sangon T_m)温度下复性，则可能使部分条带缺失(图 1C)，Wallace公式计算的T_m预测值介于两者之间，扩增条带清晰(图 1B)，而“Touch down"方法可在获得较好分辨率的基础上，具有更好的重复性(图 1D)。本研究确定以3种方法预测的引物T_m值的平均值为基础，采用“touch down"策略，即退火温度采取递减的方式进行PCR共运行35个循环第1个循环退火温度为T_m+12 ℃，第2个循环为T_m+8 ℃，第3个循环为T_m+4 ℃，第4~33个循环在正常的T_m下运行，进行ISSR-PCR，PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，染色后拍照。

2.2 基因组DNA扩增结果及多样性分析

所合成的19个引物，其中引物ISSR05和ISSR16不能得到稳定的扩增带，其余的17个引物均能在供试的5个种群松毛虫DNA扩增出稳定的特异带，扩增片段的长度在约250~2 000 bp，从中选出13组扩增条带较多、信号强、背景清晰的ISSR-PCR反应用于数据分析(表 1)。表 1结果表明，13个引物共扩增出74条DNA条带，其中，多态性DNA条带37条，占总带数的50%。每个引物扩增的DNA带的数量在4~7条，平均5.7条，多态性条带平均2.8条。

2.3 种群间遗传关系的聚类结果

采用有带记为1, 无带记为0的原则, 根据Nei (1978)的方法计算出5个种群间的遗传距离(表 2)。各种群间的遗传距离在0.114 4~0.475 4之间。根据统计分析结果，用UPGMA法构建了5个马尾松毛虫的分子系统树(图 2)。由图 2可见，丽水和永康种群的遗传距离最近，为0.114 4，富阳与洞头种群的遗传距离最远，为0.475 4。

3 结论与讨论

松毛虫是我国最重要的森林害虫，关于松毛虫的防治和研究在我国开展已相当普遍，但关于种属间关系及遗传特性等方面的基础研究甚少。本研究利用ISSR分子标记研究浙江省5个不同地区马尾松毛虫地理种群间的分子遗传差异，结果显示：所研究的5个地理种群中，除洞头种群外，其余4个种群间遗传差异较小。

张爱兵等(2004)用RAPD指纹谱的方法首次对松毛虫属8种主要松毛虫的亲缘关系进行了初步探讨，为阐明松毛虫属中8种主要松毛虫的亲缘关系提供了分子生物学证据。与RAPD相比，ISSR由于使用的引物较长，退火温度较高，从而增强了试验的可重复性。但PCR扩增产物在检测过程中常出现影子带现象，给等位基因的判读带来困难，研究易出现偏差。要消除影子带现象，可从2个方面优化PCR反应体系。一是由于简单重复的寡核苷酸引物在基因组上滑动，使PCR扩增后得到大小相差很小的PCR产物，造成检测时出现影子带。要防止ISSR引物的滑动，在引物设计中可采用锚定方法(Zietkiewicz et al., 1994)。本研究所用的13个引物，除ISSR01引物外，均采用2碱基锚定引物。另一种减少影子带的方法是选择合适的退火温度。但确定退火温度比较复杂，除了根据计算T_m值的经验公式推算外，还要凭借自己的经验。在本试验中，采用3种不同的引物T_m值经验公式预测ISSR引物的T_m值，不同公式的预测值并不相同，最大相差达10 ℃，为了得到好的扩增式样，本试验在平均T_m值的基础上，采用“Touch down"策略(Sharma et al., 1995)，获得了较好的研究结果。

ISSR标记的等位基因遵循孟德尔遗传规律，呈共显性遗传。利用ISSR标记可进行多种群间的聚类分析，据此分析种群的遗传变异程度、生存稳定性，初步评估物种的遗传多样性及种群间的亲缘关系与分化关系等。本研究所获得的ISSR片段中，共同片段较多，与报道的ISSR标记在其他物种比较而言，多态性比例并不是很高，各种群间遗传差异较小，可能是由于样本采集均来自浙江省，地域及环境条件相差不大，种群间遗传交流比较容易，因此各种群间遗传距离较近。而洞头属海岛，与大陆分离，使得洞头种群与大陆种群的遗传交流受到一定限制，表现出与大陆种群较大的遗传距离。