林业科学  2008, Vol. 44 Issue (1): 85-89   PDF    
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邱源, 韩华柏, 李俊强, 侯春霞, 王永清.
Qiu Yuan, Han Huabo, Li Junqiang, Hou Chunxia, Wang Yongqing
23个油橄榄品种的RAPD分析
RAPD Analysis of 23 Olive (Olea europaea) Cultivars
林业科学, 2008, 44(1): 85-89.
Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(1): 85-89.

文章历史

收稿日期:2006-10-16

作者相关文章

邱源
韩华柏
李俊强
侯春霞
王永清

23个油橄榄品种的RAPD分析
邱源1,2, 韩华柏3, 李俊强4, 侯春霞1, 王永清1     
1. 四川农业大学林学园艺学院 雅安625014;
2. 四川省自贡市农业局 自贡643000;
3. 四川省林业科学研究院 成都610081;
4. 四川省宜宾职业技术学院 宜宾644003
摘要: 采用RAPD技术对23个引种的油橄榄品种进行分类和鉴定研究。从80个10 bp的随机引物中筛选出11个扩增效果较好的引物进行扩增, 共产生127条带, 其中78条为多态性带, 占61.4%, 平均每个引物扩增的DNA多态性带数为7.09条。4个品种具有特异的位点, 可作为种质鉴定的依据。根据扩增结果构建反映品种间亲缘关系的UPGMA聚类图, 23个品种可划分为2大类。
关键词:油橄榄    RAPD分析    品种分类    遗传多样性    
RAPD Analysis of 23 Olive (Olea europaea) Cultivars
Qiu Yuan1,2, Han Huabo3, Li Junqiang4, Hou Chunxia1, Wang Yongqing1    
1. College of Forestry and Horticulture, Sichuan Agricultural University Ya'an 625014;
2. Zigong Agricultural Bureau, Sichuan Province Zigong 643000;
3. Sichuan Academy of Forestry Chengdu 610081;
4. Yibin Vocational and Technical College, Sichuan Province Yibin 644003
Abstract: Random amplified polymorphic DNA (RAPD) was used to study the classification and identification of 23 olive (Olea europaea) cultivars. Eleven 10 bp primers selected from eighty arbitrary primers were applied for amplifying the olive DNA. Total 127 bands were produced, among which 78 bands (61.4%) were polymorphic. The average numbers of polymorphic DNA bands amplified by each primer were 7.09. There were specific bands in four cultivars which can be used in olive germplasm identification. A dendrogram showing genetic relationships was constructed through an unweighted pair-group method (UPGMA) based on the DNA polymorphism and the 23 cultivars were clustered into 2 main groups.
Key words: olive (Olea europaea)    RAPD analysis    cultivar classification    genetic diversity    

油橄榄(Olea europaea)原产于小亚细亚和叙利亚及其东部邻近地区, 而后扩展到希腊, 是地中海地区重要的亚热带常绿果树和木本油料树种。1964年之后许多著名油橄榄品种陆续引种到我国。近年来, 由于市场需求剧增, 油橄榄生产在我国出现迅猛发展的势头, 油橄榄产业已被列入四川、甘肃等部分省区的支柱产业发展计划。但我国引种的油橄榄品种, 由于缺乏管理, 品种同名异物、同物异名的现象较为严重, 给生产和科研造成很多不便。对引入我国的油橄榄品种进行鉴定、分类和遗传多样性研究势在必行。Lychnos (1946)对油橄榄品种资源进行了系统的调查, 并根据形态学特征对其进行分类。近年来, 国外开始采用同工酶(Loukas et al., 1983)、RAPD(Besnard et al., 2001b)、AFLP(Owen et al., 2005)、SSR(Cipriani et al., 2002)和ISSR(Terzopoulos et al., 2005)等生化和分子标记进行油橄榄遗传多样性研究。在我国, 油橄榄品种分类、鉴定和遗传多样性等研究至今未见报道。本研究利用RAPD技术评价23个油橄榄品种的遗传多样性, 为进一步引种、育种材料选择和种质资源保护提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为种植在四川省开江县油橄榄品种园的23个引种品种, 其品种名称和来源地如表 1

表 1 试验所用品种的名称与来源 Tab.1 Olea europaea cultivars and their origin used in the study
1.2 基因组DNA提取

取各品种的幼嫩叶片用冰袋保鲜带回实验室, -20 ℃短期保存备用。参照Murray等(1980)的方法有所改动, 用CTAB法提取油橄榄基因组DNA, 提取物用100 μL去离子水溶解, 以分光光度计测定DNA的浓度和纯度, 并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性, -20 ℃保存。使用前将DNA原液稀释为40 ng·μL-1的工作液用于PCR扩增。

1.3 引物选择

采用上海生物工程有限公司生产的S系列引物。随机选取80个引物并从其中筛选出多态性效果较好的11个引物用于PCR扩增。

1.4 PCR扩增

PCR扩增的总体积为20 μL, 包括40 ng的模板DNA, 10×PCR buffer 2 μL, 1.5 mmol·L-1MgCl2, 0.2 mmol·L-1 dNTP, 0.25 μmol·L-1引物, Taq酶1U。PCR反应在PTC-100型基因扩增仪(美国MJ公司生产)中进行。扩增程序为:94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性45 s, 36 ℃退火1 min, 72 ℃ 2 min, 40个循环(94 ℃变性45 s, 36 ℃退火1 min, 72 ℃ 2 min)后在72 ℃延伸4 min, 结束后在4 ℃条件下保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳3 h, 溴化乙锭染色, Syngene凝胶成像仪检测, 观察拍照。

1.5 数据统计与分析

电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板DNA互补的一对结合位点, 可记为1个分子标记(戴思兰等, 1998)。每个反应重复2次, 以2次重复中稳定出现的扩增带作为统计对象, 有电泳带记为l, 无电泳带记为0, 形成0/l矩阵图输入计算机。利用NTSYSpc (2.10)软件进行分析, 相似系数采用Dice系数, 最后用UPGAM方法聚类。

2 结果与分析 2.1 扩增结果

用所筛选出的11个10 bp随机引物对23个品种进行扩增, 图 1是引物S1002和S1029扩增的RAPD图谱, 结果表明:选用的l1个引物扩增出的谱带从4条(S21)到17条(S1002)不等(表 2), 共扩增出l27条重复性好、谱带清晰的DNA带, 其中78条具多态性, 占总带数的61.4%, 表现出了丰富的多态性。平均每个引物扩增的DNA带数为11.55条, 多态性DNA的带数为7.09条。扩增出的DNA片段在300~2 000 bp之间, 其中尤以500~1 200 bp之间最多, 说明该组植物表现多态性的范围较宽, 扩增的DNA片段较小。所有品种具有相同的主扩增带, 多态性表现在其他谱带上, 在一定程度上说明了各品种之间具有同源性, 也表明油橄榄遗传背景的复杂性。

图 1 引物S1002、S1019和S1011对油橄榄基因组DNA扩增的RAPD带型 Figure 1 Banding pattern of olive cultivars amplified by the primer S1002, S1019 and S1011 M: DNA标准分子量DNA marker; 1-23:品种序号, 见表 1。No.of cultivars, see Tab. 1.
表 2 RAPD所用的11个引物及其序列 Tab.2 The primers used for RAPD analysis and their sequences
2.2 RAPD特异标记

在不同引物的扩增产物中, 仅个别品种在某一片段长度有条带出现, 这种其他样本所不具备的带可作为该种材料的特异标记。23份材料中, 阿维金娜在S1011-600 bp处、小果卡林在S1019-1 400 bp和S1025-2 400 bp处、佛奥在S1025-400 bp处有特异扩增产物。除此之外, 还可观察到特异性缺失条带, 如科拉蒂娜在S1011-650 bp处缺失条带, 这些特异性扩增带和特有缺失带可作为重要的分子性状用于油橄榄种质的鉴定。

2.3 油橄榄品种的聚类分析

将根据RAPD标记建立起来的油橄榄品种亲缘关系树状图(图 2)以0.754处作一结合线, 可将各品种分为2大类:第Ⅰ类为小果卡林、西班牙美人、切姆拉尔、科拉蒂娜和马拉约罗; 第Ⅱ类为科新·佛奥、贺吉、玉蝉44、格里昂、贝拉等18个品种, 以0.782处作一结合线该类可进一步分为4个亚类。亚类ⅰ有10个品种, 科新·佛奥、贺吉、玉蝉44、格里昂、贝拉、奥布卡、皮肖林、阿维金娜、佛奥和曼扎尼诺; 亚类ⅱ品种为玉蝉·佛奥和坦彩; 亚类ⅲ有配多灵和突尼斯; 亚类ⅳ为奥格里阿罗拉、莱星、威尔迪亚尔和萨罗(青果)。

图 2 根据RAPD结果构建的23个油橄榄品种亲缘关系树状图 Figure 2 The dendrogram of 23 olive cultivars based on RAPD results
3 讨论

本研究用筛选出的11个引物, 将23个油橄榄品种完全区分开, 说明RAPD标记是鉴定和区分油橄榄品种的有效手段, 进一步证实了RAPD标记技术鉴定油橄榄品种的可行性。本研究中RAPD多态性带的比率为61.4%, 表明油橄榄品种间的多态性程度较高。这可能是由于油橄榄品种具有不同的种质起源, 并在漫长的进化和栽培过程中与野生油橄榄相互杂交产生的结果(Contento et al., 2002; Martins-Lopes et al., 2007)。根据油橄榄品种亲缘关系树状图将23个油橄榄品种分为2大类。第Ⅰ大类中的5个品种有不同的地理起源, 除西班牙美人外, 其余品种的果形较小为油用品种。第Ⅱ大类中的18个品种可进一步分为4个亚类, 亚类ⅰ中除玉蝉44、阿维金娜和佛奥外, 其余品种均为果实较大的油果两用或果用品种; 亚类ⅱ、亚类ⅲ的大部分品种(除坦彩)为油用品种; 亚类ⅳ品种的果形大或者中等, 奥格里阿罗拉和莱星的用途为油用, 其余品种为两用品种, 这一类品种的抗寒能力较强。本研究的结果表明, 大多数油橄榄品种, 并没有根据其地理起源而是依其果实大小、抗寒力和用途聚类, 与前人研究结果基本一致(Besnard et al., 2001b; Claros et al., 2000; Fabbri et al., 1995)。这可以解释为在漫长的栽培历史中, 出现了几次大规模的引种过程, 使油橄榄种质间发生频繁的基因交流, 在人工选择的作用下以经济性状作为标准产生的结果。本研究中, 马拉约罗和莱星分别属于不同的大类, 而Angiolillo报道两者的亲缘关系较近(Angiolillo et al., 2006); 坦彩和皮肖林并不在同一亚类, 而在Besnard等(2001a)的研究中, 两者属于同一类而且相似系数的水平较高, 这可能是由于所用分子标记技术和引物数量的不同造成的。

油橄榄的栽培历史悠久, 品种繁多, 同物异名、同名异物现象十分普遍。分子标记技术是解决油橄榄品种同物异名、同名异物现象的有效手段(Nikoloudakis et al., 2003; Rotondi et al., 2003)。科新·佛奥和贺吉的RAPD图谱几乎相同, 相似系数为0.98, 在前人的研究中科新·佛奥和贺吉在系统树中分别处于不同的类群中。科新·佛奥是典型的油用品种, 果实较小, 贺吉是油果两用品种, 2个品种的叶型等形态学特征也有较大差异, 可能出现了同物异名的现象。在这一亚类中大多数的品种均为果实较大的两用或果用品种, 因此2个品种有可能都是贺吉, 可能在引种和保存过程中出现了错误。同时研究表明佛奥、玉蝉·佛奥这2个品种的亲缘关系较远, 这说明具有相似品种名的品种, 并没有相似的遗传背景。

RAPD分析结果表明油橄榄的多态性程度较高(表 3), 从分子水平上初步证明油橄榄种质广泛和复杂的遗传背景。在实际应用中可以根据聚类分析的结果指导亲本选配, 选择亲缘关系较远的材料, 增加后代的遗传变异, 选育出杂种优势更强、综合性状更好、更适合我国气候条件的优良油橄榄品种。

表 3 23个油橄榄品种相似指数的比较 Tab.3 Similarity index between pairs of 23 olive cultivars
参考文献(References)
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