0　引　言

海洋生物污损是指海水环境中污损生物在结构物表面的聚集与附着，以及由此带来的不良影响。海生物污损给海洋船舶与人工设施造成极大的危害，例如海生物污损会增加船体自重和船体摩擦阻力，从而增加燃油消耗，增加温室气体排放和维护费用；海生物污损会堵塞滨海电厂和船舶海水冷却管道，影响设备正常运行；海生物污损会加快金属腐蚀，从而大大降低海洋环境下零部件的使用寿命并影响安全性；另外海生物污损对水产养殖也有严重影响。因此必须采取必要的措施防除海生物污损。防除海生物污损的方法多种多样，其中涂刷防污涂料是海洋船舶、海洋养殖等行业最为经济有效的方法。有机锡（TBT）由于严重危害海洋生态环境，世界各国纷纷立法禁止有机锡防污涂料的使用。联合国所属的国际海事组织为加强海洋环境保护，通过了《国际控制船舶有害防污涂料系统公约》，自 2008 年 1 月 1 日起所有船舶上完全废除TBT涂料^[1]。氧化亚铜作为目前无锡防污涂料的主要防污剂，同样存在严重的环境污染问题。研究发现铜对一些海藻有毒，并在甲壳类动物中积累，这引起人们对铜基漆的关注^[2]。加拿大、瑞典已经对氧化亚铜在防污涂料中的使用作了限制，美国按照统一国家排放标准限制其在特定区域使用。因此氧化亚铜作为防污剂最终也会面临禁用，发展低毒/无毒、对环境友好的防污技术势在必行。酶是具有生物催化功能的生物大分子，与化学作用相比，具有反应条件温和、效率高、专一性强、副反应少、对环境友好等优点，目前已广泛应用于医药、化工、食品等多种行业，酶在海生物污损防除中的巨大应用潜力也已引起世界各国广泛关注和深入研究，成为新型环境友好防污材料发展的重要方向之一^[3]。由于污损生物的附着均是从幼虫阶段分泌黏附物质开始的，因此研究、探讨污损生物黏附物质的组成与黏附机制，对于针对性发展酶基防污技术具有重要意义。

1 污损生物黏附机制

一般来说，生物污损过程大致如下：首先，一些有机物和无机物被吸附在材料表面，形成条件膜。条件膜的形成改变了材料表面的特征，如所带电荷的电性、亲水憎水性等，这些改变很大影响了细菌、微藻的附着^[4]。微生物附着后，不断生长繁殖，其分泌的粘液可黏附物质颗粒及微生物，最终形成一层具有一定厚度的微生物膜。微生物膜为大型污损生物提供了丰富的营养物质和良好的生长环境，它们的幼虫或孢子黏附在生物膜上，并不断地发育生长，分泌各种高强度黏附胶附着在物体表面，最终发展形成大型生物污损层。

1.1 污损微生物

微生物通过胞外聚合物（EPS）黏附在材料表面，形成微生物膜。微生物膜又可以分为细菌层和微藻层，微藻层的形成受细菌的影响^[5]，且细菌的存在影响硅藻的生长^[6]。

EPS是形成微生物膜的重要物质，细菌的胞外聚合物由多聚糖、蛋白质、核酸、糖蛋白、磷脂等成分构成。不同种类的细菌胞外聚合物各组成成分含量不一样，同种细菌在随环境改变时，其胞外聚合物各组成成分含量也有变化^[7]。多聚糖和蛋白质是细菌胞外聚合物的重要组成成分。其中多聚糖具有高度异构性，包含不同的单糖单位和无机取代基。不同细菌胞外聚合物的多糖组分差异很大，既可是简单的均聚糖也可是较为复杂的杂聚糖，它们分子量在 10 ³～10 ⁸ kDa之间。均聚糖是单一的链接类型，其重复单元是一种单糖，杂聚糖是由 2～8 单糖长度的重复单元构成，其重复单元是由多种单糖组成。此外，不同细菌的胞外聚合物中蛋白质的组分差异也很大，但胞外蛋白质的作用很大，它可调节胞外多糖的分泌，影响生物膜结构，促进微生物在材料表面附着^[8]。细菌形成生物膜过程中，膜内的细菌之间不是孤立的，它们是通过群体感应（QS）进行沟通交流，群体感应涉及一些信号分子，而高丝氨酸内酯（AHL）^[9]就是其中一类。生物膜的形成，群体感应起到基础性作用，且群体感应还控制着细菌的群集、毒素及二次产物的产生。

微藻种类繁多，其中硅藻是最为重要的一种。海洋环境下，硅藻是形成生物膜主要参与者。硅藻的胞外聚合物主要由羧化或硫酸盐化的酸性多糖组成，也含有少量蛋白质。不同种类硅藻的胞外聚合物有很大差异，主要表现在蛋白质片段以及复杂结合的单糖、硫酸酯或糖醛酸上。但也有研究通过二级粒子飞行时间质谱发现，有些硅藻的胞外聚合物中多糖有相同的结构片段^[10]。此外，同种硅藻在不同条件下胞外聚合物成分组成可能不相同。有些硅藻胞外聚合物成分会随季节的变化而变化^[11]，有些硅藻会随黏附壁面性质的改变而改变分泌液的成分^[12]，因此硅藻的胞外聚合物成分十分复杂。

1.2 大型污损生物

随着微生物膜的生成，一些大型污损生物的幼虫或孢子开始在材料表面附着，进而生长，发育成生物群落，造成严重的生物污损。大型污损生物中最为典型的生物为藤壶、贻贝及大型藻类。

藤壶幼虫选择合适的材料表面进行附着、发育，在这过程中其向外分泌胶质—藤壶胶，进行牢固黏附。研究发现，藤壶胶的化学组成（如碳、氢、氮等）会随基底不同而有较大差异^[13]。同时，藤壶胶的交联微结构随基底的改变也有很大变化^{[13 –14]}，如当藤壶胶在聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘结时，其结构为比较松乱的网状结构；当藤壶在金属表面黏附时，其分泌出呈球状，纤维状的胶液，最终形成的结构比较致密。Kamino从藤壶胶中分离出Mrcp-100k、Mrcp-68k、Mrcp-52k、Mrcp-20k、Mrcp-19k等蛋白质，前 3 种蛋白质的分子量较大，表现为不溶性及疏水性^[15]。其中Mrcp-100k和Mrcp-52k这 2 种蛋白占据藤壶胶比重较大，它们分子间主要通过二硫键相互作用。Mrcp-68k蛋白在藤壶胶中含量很高，但其对藤壶的附着影响较小。而另 2 种蛋白质Mrcp-20k和Mrcp-19k含量很少，但它们在藤壶附着过程中作用很大。Mrcp-19k蛋白质含有丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和赖氨酸等固定的氨基酸残基，它在藤壶胶黏附表面过程中起到功能性作用^[16]。Mrcp-20k蛋白含有大量的半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸等氨基酸残基，该蛋白分子间不存在二硫键，但分子内部存在大量的二硫键。Mrcp-20k蛋白使藤壶更好地黏附在钙质基底上，尤其是贻贝外壳^[17]。另外，最近研究结果表明藤壶胶不仅仅是由多种黏附蛋白组成，还含有一定量的脂肪，幼虫附着时首先分泌出脂肪，取代附着基底表面的水分，为黏附蛋白的引入创造有利的环境，脂肪和蛋白协同作用，附着强度达到最强^[18]。

贻贝附着在物体表面是通过足丝腺分泌具有黏附性能的胶液实现的，这种胶液固化后形成足丝。足丝由胶原前体、黏附蛋白等组成，其中黏附蛋白是足丝的主要成分，主导着贻贝的附着。贻贝之所以可以在水中具有良好的附着效果，黏附蛋白中的 3, 4-二羟基苯丙氨酸（多巴，DOPA）起着关键作用，DOPA的存在使得贻贝黏附在性质各异的基底表面上^[19]。贻贝足丝中主要含有Mefp1、Mefp2、Mefp 3、Mefp 4、Mefp 5 这 5 种蛋白，其中Mefp1 是最大的蛋白，由 75～80 个多肽重复片段组成，其分子量为 108 kDa，DOPA含量约 10 mol%～15 mol%^[20]。Mefp3 和Mefp5 是足丝与外界表面粘合的主要黏附蛋白，这 2 种蛋白中DOPA含量很高。Mefp3 为最小的蛋白，分子量为 5 kDa，其序列中氨基酸含量由多到少依次是多巴（DOPA）、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺，其中DOPA含量约 28 mol%。Mefp5 分子量约为 9.5 kDa，DOPA含量最高，达 30 mol%。

大型藻类黏附在基材表面经历以下阶段：1）孢子初始附着；2）孢子分泌黏附剂，粘结附着；3）孢子产生附着假根。在藻类孢子附着的初始阶段，材料表面的菌类胞外聚合物起着重要作用，能够促进孢子的附着^[21]。藻类孢子分泌的黏附剂本质就是多糖蛋白。这种黏附剂中酚的含量较高，酚的存在使得黏附剂交联固化^[22]，从而增强了粘结强度，同时阻隔了粘结表面与外界，进一步加强藻与基体间的粘结强度。

2 酶防污技术研究进展

海洋污损生物黏附机制研究发现海洋污损生物附着基础大抵相同，其黏附物质包含了蛋白质类、多糖类和脂质类等物质。生物酶，由于其生物催化作用，可以对污损生物的附着产生有效的抑制作用。基于酶的分解作用直接分解污损生物黏附物质，例如蛋白酶分解蛋白类黏附物质、淀粉酶分解多糖类黏附物质、脂肪酶分解脂质类黏附物质等，可归为酶的直接防污；通过酶作用于环境中的其他底物产生具有生物杀灭作用的活性剂进行防污可归为酶的间接防污。在防污酶应用过程中，需要将酶进行固定化来改善其性质，如热稳定性、抗酸碱性等，从而满足防污要求。

2.1 酶直接防污技术

由于生物膜及污损生物黏附物质的主要成分为多糖、蛋白质和脂质等物质，因此作用于该物质的水解酶可以更好地防止生物污损。

Leroy等^{[23 –24]}研究几种商业化水解酶（糖酶、蛋白酶和脂肪酶）对细菌附着形成生物膜的影响。研究表明蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）是预防细菌附着和清除已附着细菌效果最好的水解酶，其他水解酶效果一般，有些水解酶甚至会增加细菌的附着。Zanaroli等^[25]人研究发现几种水解酶混合使用能有效防止生物膜的形成，防污效果比单一种类水解酶要好。此外，有研究分别测定枯草杆菌蛋白酶、纤维素蛋白酶对绿脓杆菌和表皮葡萄球菌附着的影响，结果显示纤维素蛋白酶有效减少了表皮葡萄球菌的附着，但对绿脓杆菌没有影响，而枯草杆菌蛋白酶作用效果相反^[26]。这表明了有些酶催化具有针对性，多种酶联合作用才能起到广泛的防污效果。Mariana等^[27]发现固定化枯草杆蛋白酶可以减少石莼孢子和硅藻的附着，有效降低硅藻的黏附强度。Peres等^[28]用含有木瓜蛋白酶涂层在地中海做了为期 7 个月的测试，发现木瓜蛋白酶具有优良的防污作用。另外一种防污效果比较好的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，它不仅可以降解生物膜，而且对大型生物黏附物质有分解作用。丝氨酸蛋白酶可降解生物膜，其生物膜可以是单一菌种生物膜也可以是多种细菌生物膜^{[29 –30]}，这充分体现了丝氨酸蛋白酶对生物膜的降解具有普遍性。Pettitt^[31]研究丝氨酸蛋白酶对藤壶附着的影响，结果表明在丝氨酸蛋白酶的作用下，藤壶幼虫附着足迹明显减少，这说明丝氨酸蛋白酶可以降解藤壶所分泌的胶液，减少了藤壶幼虫在材料表面的附着。Nick Aldred利用原子力显微镜研究了丝氨酸蛋白酶对藤壶胶质的降解作用，数据显示蛋白酶作用 600～1 400 s后，胶质的附着力从 340 pN降为 150 pN，随后直线降至 0，丝氨酸蛋白酶作用 26 min后藤壶幼虫分泌的胶质完全被分解。

另外，一些酶如细胞壁溶解酶、几丁质酶、玻璃酸梅、溶解酵素酶可以直接影响生物体的生存。几丁质酶可以溶解甲壳素，而甲壳素是藤壶壳的组成成分，此酶对藤壶的防污效果比较显著。玻璃酸酶可以分解细胞组织组成玻璃酸，从而增加细胞组织渗透性，影响生物的生存。

前文提到了群体感应信号分子在生物膜形成中有着重要的作用，文献[32]结合最近研究进展详细讲述了群体感应对生物膜的影响及如何通过阻止群体感应来抑制生物膜的生成。革兰氏阴性菌的群感效应分子N-酰化高丝氨酸内酯类物质（AHL）是快速形成生物膜的基础。研究发现通过酰基转移酶降解AHL，生物膜的形成明显受到了抑制^[33]。

2.2 酶间接防污技术

酶可以作用于环境中其他底物产生具有生物杀灭作用的活性物质，常见的活性物质为过氧化氢、水卤酸等。有关研究表明，从涂层中或海水中获得的底物与涂层内的氧化酶反应可以生成过氧化氢，从而起到一定防污效果^[34]。过氧化氢可以从海水中的蛋白质或多糖产生，其涉及一系列酶促反应，首先是前驱酶（蛋白酶或者糖酶）将蛋白质或多糖转化为氧化酶催化反应所需的底物，继而转化为过氧化氢。Biolocus公司申请的美国一项专利公开了一种用酶催化产生过氧化物作为防污剂的防污涂料^[35]。Kristensen^[36]等利用淀粉酶和己糖酶构成的涂层可稳定释放过氧化氢，具有高效防污性能，含酶涂层相对于不含酶涂层，附着藤壶数量及微生物覆盖面积明显减少。然而酶防污涂层要想真正实现商业应用，酶的催化活性必须在一定的时间内保持稳定^[37]。Wang H等^[38]在实验室条件下，把淀粉酶和葡萄糖氧化酶封装在二氧化硅防污涂料中，涂层可以以较高的速率稳定释放过氧化氢，持续时间长达 3 个月。此外，酶催化生成过氧化氢的持续时间很大程度上受温度的影响，Olsen等^[37]用含淀粉酶和葡萄糖氧化酶涂层在不同海域测试，发现在温度比较低的海域，涂层持续释放过氧化氢时间较长，该涂层在低温区域应用效果更加明显。基于温度对防污酶控制释放的影响，可将防污酶经过适当方法进行固定化来改善酶的热稳定性，从而实现酶在特定温度范围内的应用。丹麦酶制剂公司GENECOR公司与涂料生产厂商HEMPEL公司合作研发基于葡萄糖化酶和己糖氧化酶联合作用生产双氧水的防污技术，目前该技术已经成功应用到防污涂料中，并已开始实船应用。此外，工业上常用次氯酸杀死生物，从而起到防污效果，这种强氧化性水卤酸活性剂也可以通过酶催化反应得到。将卤过氧化酶加到涂层表面，卤过氧化酶会把含有过氧化氢和含卤离子的海水转化为水卤酸，如次氯酸，这种酸具有比过氧化氢更强的防污效果。但是自然海水中的过氧化氢含量很低，过氧化氢的供应不足成为这种防污方法的主要缺点。

2.3 防污酶的固定化技术

对基于防污酶的新型防污涂层材料来说，加入涂料体系中的每一种酶，必须保证其在涂料当中的活性和稳定性。酶的活性及其稳定性受到诸如温度、pH值和盐度等环境参数的影响，游离的酶在水溶液中的稳定性也很差，容易发生自消化反应，使酶催化反应难以控制，催化效率大大下降，另外防污酶中的蛋白酶除了能催化降解污损生物黏附蛋白质，也能催化降解其他的酶。因此，防污酶在应用过程中必须通过载体材料包封以使之彼此隔离，即进行酶的固定化处理。

针对防污酶的固定化，各国学者开展了大量工作并取得了一定成效。酶常用固定方法可根据作用力分为：物理吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。酶固定化载体主要分为无机载体和有机载体两大类，前者主要有硅藻土、硅胶、多孔玻璃、介孔分子筛等多孔无机材料，后者主要包括天然高分子载体（如海藻酸钠、纤维素、壳聚糖等）和合成有机高分子载体（如大孔树脂、合成纤维等）^{[39 –41]}。物理吸附法是指利用各种固体吸附剂通过非极性力，如范德华力、疏水作用力、氢键等弱相互作用将酶或酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法，属于可逆固定法^[42]，酶可在温和的条件下从载体表面移除。包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在纤维、框架结构材料或聚合物薄膜等多孔载体中使酶固定化的方法，是不可逆物理固定法^[43]。包埋法可提高酶的机械稳定性，减少酶的滤出。由于酶与载体间没有化学作用，通常可避免酶的变性^[44]。该方法可通过优化、改性包埋材料，为酶创造合适的微环境。包埋材料一般包括聚合物、溶胶凝胶和其他无机材料，常用的包括硅藻酸盐、交叉胶、胶原蛋白、聚丙烯酰胺、明胶、硅橡胶、聚亚胺酯和聚乙烯醇等。然而，该方法在实际应用过程中受到诸多限制：待固定酶受包埋载体空隙大小影响显著，包埋载体空隙太大易导致酶大量泄漏，空隙太小则负载或吸附能力较低；固定化过程中酶易被钝化；包埋载体容易团聚，阻碍酶的活性位点面向底物。交联法也是酶固定化方法中的不可逆法之一，也称作无载体固定法^[45]。交联法通过多功能基团反应物在酶分子间形成交联作用，最常用的交联剂为戊二醛。酶固定化方法中应用最为广泛的是共价结合法，通过共价键将酶与载体结合在一起。参与共价结合的酶侧链功能基团包括赖氨酸（ε-氨基酸基团）、半胱氨酸（硫醇基团）、天门冬氨酸和谷氨酸（羧酸基团、咪唑、酚基）。共价结合酶的活性受到载体材料尺寸、结合方法、载体材料组成以及结合过程中特殊条件等因素的影响。共价结合法使酶与载体间形成了强有力的结合，阻止酶过快的释放到反应环境中，提高酶的再用性。另外通过与多孔硅胶、壳聚糖等共价结合，还能增强酶的稳定性，延长酶的半衰期^[46]。Dandavate^[47]、Ma^[48]将假丝酵母脂肪酶共价固定在改性硅纳米粒子上，Yilmaz^[49]将假丝酵母脂肪酶共价固定在经戊二醛活化的玻璃微珠表面上，Vendittia^[50]将假丝酵母脂肪酶共价固定在改性的金纳米颗粒上，Yuce-Dursun^[51]则将假丝酵母脂肪酶共价固定在溶胶-凝胶法制备的环氧树脂聚合物薄膜上，通过这些方法获得的固定酶具有高的重复利用率及较好热稳定性。Balistreri等^[52]将葡糖糖氧化酶共价固定在介孔硅材料上，有效提高了酶的抵抗高温及有机溶剂的稳定性。Huijs等^[53]通过聚合物中的环氧基、乙酰乙酸基、醛基、氯甲基等进行酶的共价固定，将蛋白酶、葡萄糖氧化酶、α-淀粉酶、脂肪酶作为防污涂料的首选酶，防污测试结果表明，这些共价固定酶可以产生有效的防污效果。杜克大学申请的美国专利US5998200 中公开了一种用酶做主要防污剂的防污涂料，同样采用共价固定法，将丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、几丁质酶、番木瓜蛋白酶、链霉菌蛋白酶、β-淀粉酶、糖苷酶、纤维素酶、果胶酶、胶原酶、透明质酸酶、β-葡（萄）糖苷酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、羧基肽酶、嗜热菌蛋白酶等多种酶进行固定化^[54]。

总之，固定化酶即保持了酶的催化特性，又克服了酶的不足之处，可在很大程度上提高酶的环境稳定性并保持酶的活性。因此防污酶的固定化成为酶在海洋防污应用过程中必须克服的关键技术之一。

3 酶防污技术面临的问题与发展前景

开发酶基防污涂料时，需要满足 4 个要求：1）防污酶要具有广谱性；2）防污酶加入到涂料中后要保持活性；3）酶在涂层中及在海水中，其活性保持长期稳定；4）酶的加入不得降低涂料的使用性能。从这些要求可以看出，要设计出一个可行的酶基防污涂料体系，需要解决酶与酶、酶与涂料之间的问题。这给设计出合适的酶防污涂料带来更多的困难。虽然目前已通过一些技术手段在一定程度上解决了以上问题，但要把酶基防污涂料广泛应用到工业中的路途仍艰难遥远。

总体来说，针对污损生物黏附物质组成及黏附特点开发酶基防污技术，通过酶的固定化提高酶在涂料体系中的稳定性，通过包覆技术消除各种酶之间的相互影响，是目前酶基防污技术的主要研究方向。酶基防污技术作为一种可行性较高的新型环保防污技术，目前已取得了显著的研究进展，部分国际大型涂料公司均有研究开发计划，具有广阔的应用前景。