多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)广泛存在于环境中，人们可以通过多种途径暴露于PAHs。由于芘是PAHs的主要成分，其尿中代谢产物1-羟基芘(1-OH-P)含量丰富且相对容易测量，人体暴露PAHs通常通过监测尿液标本中1-OH-P水平进行评估[1]。PAHs进入人体，在混合功能氧化酶如细胞色素P450等Ⅰ相反应酶作用下，生成活性更强的环氧化物。在这个过程中会产生大量活性氧(ROS)，造成DNA氧化损伤，DNA修复基因在抗损伤过程中起着重要的作用。外源性化学物氧化应激导致的DNA损伤主要依赖碱基切除修复通路(BER)。X射线交错互补修复基因1(XRCC1)、人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)基因位点是BER途径的主要影响因子，其多态性与DNA碱基切除修复能力密切相关。近期大量研究显示上述基因多态性与各种恶性肿瘤发生及预后密切相关，但是DNA碱基切除修复基因多态性与孕产妇宫内暴露PAHs之间的研究较为匮乏。本研究以乌鲁木齐市的115名孕产妇为研究对象，通过问卷调查及实验检测结果分析，进一步阐明孕产妇及新生儿碱基修复基因多态性与PAHs暴露的关联，综合评价乌鲁木齐市环境PAHs暴露对母婴DNA损伤状况。
1 对象与方法 1.1 对象选择乌鲁木齐市某医院115名孕产妇及其新生儿，孕产妇孕期均无重金属等职业接触史、农药等接触史, 无遗传疾病史。孕产妇及其新生儿进行流行病学调查和生物样品采集，所有入选对象均为签署知情同意书的孕产妇。收集孕产妇中段尿样、静脉血及分娩时新生儿脐血。
1.2 方法 1.2.1 问卷调查由经过统一培训的医务人员采用面对面的问卷调查，问卷内容包括孕产妇年龄、职业、吸烟等一般情况。采用统一标准对新生儿的身高、体重、头围、胸围、Apgar评分进行测量。
1.2.2 1-OH-P浓度测定采集孕产妇中段尿5 mL用于1-OH-P浓度的测定，用酶水解—液相色谱—质谱联用仪检测(液相色谱仪美国Thermo公司；质谱联LDM20040美国Thermo公司)，经过酶水解、固相萃取、洗脱、浓缩、定容，最终用尿肌酐进行校正。
1.2.3 DNA提取EDTA抗凝采血管收集10 mL孕产妇静脉血和20 mL新生儿脐带血，快速运回实验室，置于-80 ℃低温保存。使用DNA提取试剂盒提取血中DNA。本次研究所测得的DNA样品浓度范围为(200~1 000) μg/μL，纯度范围为1.7~1.9。
1.2.4 基因多态性检测 1.2.4.1 PCR扩增及产物测定利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术进行对孕产妇与新生儿的HOGG1326Ser/Cys基因型、XRCC1399Arg/Gln基因型的多态进行检测。以上2个基因的PCR反应体系均为10 μL体系：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，DNA模板1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR扩增循环参数为94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，55.7 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min，降至4 ℃。扩增结束后，取PCR扩增产物5 μL，置于2%的琼脂糖凝胶板电泳(100 V, 45 min)。在凝胶成像仪检验扩增效果。PCR引物来源于文献[2]，由上海生工生物工程公司合成(表 1)。
| 名称 | 序列 |
| XRCC1 Arg399Gln F | 5′-ATTGCCCAGCACAGGATAAG-3′ |
| XRCC1 Arg399Gln R | 5′-GCCCCTCAGATCACACCTAA-3′ |
| HOGG1 Ser326Cys F | 5′-AGTCTCACCAGCCCTGAC-3′ |
| HOGG1 Ser326Cys R | 5′-CTGTCTCCCTCAATATCCC-3′ |
1.2.4.2 基因型分析
PCR-FRLP体系反应体系为：PCR产物2 μL，限制性内切酶1 μL，10×TBE buffer 1 μL，ddH2O 6.0 μL 37℃水浴过夜，过夜产物置于3%的琼脂糖凝胶板电泳(100 V, 45 min)。随后凝胶成像仪观察限制性片段长度进行鉴定结果。XRCC1基因定位于染色体19q13.2, 野生型GG基因型(161 bp)，杂合型GA基因型(213、161 bp)，突变型AA基因型(213 bp)。hOGG1定位于染色体3p26.2，野生型CC基因型(338 bp)，杂合型CG基因型(338、233 bp)，突变型GG基因型(233 bp)。随机抽取的10% PCR扩增产物进行测序分析，与电泳分型结果完全符合。
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| 图 1 XRCC1399Arg/Gln基因位点的PCR电泳图(左)及基因型电泳图(右) |
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| 图 2 hOGG1326Ser/Cys基因位点的PCR电泳图(左)及基因型电泳图(右) |
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件对所收集的数据进行统计分析。对计量资料采用中位数±四分位间距进行统计描述。对个基因型的平衡性检验使用Hardy Weinberg遗传平衡检验，采用χ2检验分析基因多态性与多环芳烃浓度是否有差异。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 尿中1-OH-P高暴露组与低暴露组孕产妇及新生儿的一般情况本次研究对象是151名孕产妇和新生儿，1-OH- P高暴露组与低暴露组的新生儿的身高、体重、头围、胸围、Apgar评分及孕产妇的年龄、民族均无统计学差异，孕产妇的文化程度与1-OHP暴露有统计学意义(P＜0.01)，(表 2)。
| 人群 | 变量 | 高暴露组 | 低暴露组 | 统计量 | P值 | |
| 孕产妇 | 年龄/岁 | 16~ | 13 | 10 | ||
| 26~ | 30 | 34 | 0.997a | 0.607 | ||
| 36~ | 12 | 16 | ||||
| 民族 | 汉族 | 48 | 45 | 0.270a | 0.603 | |
| 少数民族 | 10 | 12 | ||||
| 学历 | 小学及以下 | 15 | 6 | |||
| 中学 | 19 | 8 | 13.719a | 0.001 | ||
| 大专及以上 | 24 | 43 | ||||
| 新生儿 | 体重/kg | 3.57±0.46 | 3.41±0.45 | 1.928b | 0.056 | |
| 身高/cm | 50.24±1.66 | 50.04±2.13 | 0.578b | 0.565 | ||
| 头围/cm | 34.25±1.63 | 34.10±1.60 | 0.587b | 0.558 | ||
| 胸围 | 33.43±1.69 | 33.60±1.61 | 0.423b | 0.673 | ||
| Apgar评分 | 9.33±0.51 | 9.28±0.49 | 0.470b | 0.639 | ||
| 注：“a”：卡方检验统计量χ2; “b”：t检验统计量t | ||||||
2.2 孕产妇体内PAHs的暴露状况
采用尿液中的1-OHP作为芘(Pyr, 一种PAHs)在体内最主要的代谢产物，通常被用于表征PAHs的暴露水平，本次研究中孕产妇1-OH-P的中位数及四分位间距是0.340(0.208~0.555) μg/mmol Cr，按照中位数将研究对象分为高暴露组(≥0.340 μg/mmol Cr)、低暴露组(< 0.340 μg/mmol Cr)。
2.3 碱基修复基因与PAHs暴露的关系对孕产妇及新生儿碱基修复基因XRCC1、hOGG1的基因型经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果显示，样本均来自于同一孟德尔群体。
2.3.1 XRCC1基因与PAHs暴露的关系经χ2检验统计发现，新生儿的XRCC1399Arg/Gln基因型与孕产妇的体内1-OH-P的浓度有统计学意义(P < 0.05)。提示新生儿的XRCC1399Arg/Gln突变基因型与1-OH-P高暴露有关；孕产妇的XRCC1399Arg/Gln基因型与体内1-OH-P的浓度无统计学意义(P=0.17)(表 3)。
| 人群 | 基因型及 等位基因 | 1-OH-P | χ2值 | P值 | |
| 高浓度组 (构成比%) | 低浓度组 (构成比%) | ||||
| 孕产妇 | GG | 20(48.8) | 21(51.2) | 3.15 | 0.17 |
| AG | 24(47.1) | 27(52.9) | |||
| AA | 16(69.6) | 7(30.4) | |||
| 新生儿 | GG | 18(69.2) | 8(30.8) | 6.24 | 0.02 |
| AG | 28(57.1) | 21(42.9) | |||
| AA | 14(35.0) | 26(65.0) | |||
2.3.2 HOGG1基因与多环芳烃暴露的关系
经χ2检验统计发现，新生儿的hOGG1326Ser/Cys基因型与孕产妇的体内1-OH-P的浓度无统计学意义(P>0.05)。孕产妇的hOGG1326Ser/Cys基因型与体内1-OH-P的浓度有统计学意义(P=0.04)，提示孕产妇XRCC1的突变基因型与体内PAHs的暴露有关(表 4)。
| 人群 | 基因型及 等位基因 | 1-OH-P | χ值 | P值 | |
| 高浓度组n (构成比%) | 低浓度组n (构成比%) | ||||
| 孕产妇 | CC | 12(57.1) | 9(42.9) | 6.36 | 0.04 |
| CG | 33(62.3) | 20(37.7) | |||
| GG | 15(36.6) | 26(63.4) | |||
| 新生儿 | CC | 15(53.6) | 13(46.4) | 4.19 | 0.12 |
| CG | 34(59.6) | 23(40.4) | |||
| GG | 11(36.7) | 19(63.3) | |||
3 讨论
PAHs是作为一类在环境中广泛存在的典型持久性的污染物，由煤炭、石油和烟草等高分子化合物的不完全燃烧产生的碳氢化合物，广泛分布于空气、水、土壤中，通过呼吸道、皮肤和黏膜等不同途径使人们不同程度的暴露于PAHs。目前已发现400多种PAHs及其衍生物，苯并芘就是其中之一。由于芘是PAHs的主要成分，它在尿液中的代谢产物是1-OH-P，尿液中1-OH-P的浓度常用来评价个体PAHs的内暴露剂量[3]。段小丽等[4]建议，一般城市居民尿中的生物暴露限值为0.11 μg/mmol Cr。本研究检测到孕产妇尿1-OH-P浓度是0.340(0.208~0.555) μg/mmol Cr，其中90%的孕产妇尿液中1-OH-P的浓度高于一般居民的暴露限值。也高于2010年山西太远孕产妇的尿中1-OH-P 0.10 μg/mmol Cr[5]。Limu[6]等研究显示乌鲁木齐市空气中PM2.5和PM2.5-10中苯并芘浓度范围分别为(0.11~1 058.08) ng/m3和(0.01~90.89) ng/m3，用毒性当量(BaPeq)计算评估PAHs的致癌风险，发现BaPeq在PM2.5中的平均水平是5.97 ng/m3，明显高于WHO推荐的值(1 ng/m3)5倍之多[6]。空气中PAHs水平高可能是造成孕产妇尿中1-OH-P较高的原因。
研究表明当PAHs进入人体后，高暴露组的BPDE白蛋白加合物水平、外周淋巴细胞的损伤明显高于对照组，此时细胞内染色体的修饰作用极大增强，若DNA的修复不能及时完成，累积到一定程度后，DNA的复制错误和染色体的畸变将会导致机体的遗传物质改变和细胞功能丧失或死亡[6]。BER是修复外源化学物质引起的损伤最活跃的途径。XRCC1ArgGln399(rs25487)基因位于人染色体19q13.2，在短片段的BER的过程中，XRCC1编码蛋白与DNA聚合酶β、ADPRT和DNA连接酶Ⅲ共同作用对DNA损伤进行修复。XRCCl蛋白通过在N端与DNA聚合酶β连接，C端与DNA连接酶Ⅲ连接，中部的乳腺癌易感蛋白同源羧基末端Ⅰ区(BRCTⅠ)与ADPRT相互作用，在BER过程中发挥着连接平台的作用[6-7]。目前，已发现XRCC-1399Arg→Gln的突变将致使个体对氯乙烯、苯中毒的易感性增加[8-9]，与肺癌、乳腺癌，食管癌的发病及预后有着密切的关系[10-12]。本次研究发现，新生儿的XRCC1399基因型与孕产妇的体内1-OH-P的浓度有统计学意义(P < 0.05)，提示新生儿的XRCC1突变基因型AA与1-OH-P高暴露有关，这可能与胎儿期DNA的修复功能表达不完全有关。董少霞等人研究发现脐血中PAHs的浓度与母亲相当甚至是高于母亲静脉血中PAHs浓度[13]。这也可能导致新生儿的基因突变高于母体。但目前尚无新生儿XRCC1基因多态性与孕产妇尿1-OH-P浓度的相关国内外报道。
hOGG1SerCys326(rs1052133)基因位于人染色体3p26.2，在BER通路中主要功能是特异性识别、切除8-OHDG引起的DNA损伤，hOGG1326Ser→Cys氧化损伤形成频率最高、致突变能力最强，与肿瘤的发生和发展有密切关系[10-13]。hOGG1-SerCys326的多态性可致使丝氨酸转变为半胱氨酸，降低hOGG1蛋白底物的特异性，从而减弱8-OHDG的切除能力。此外hOGG1SerCys326还具有AP裂解酶活性，在糖基化产生的AP位点将DNA链切除，以修复自发碱基丢失或因DNA糖苷酶作用后产生的、可阻断DNA复制的AP位点[14]。研究表明与hOGG1携带野生型的个体在应对DNA氧化损伤时，DNA损伤修复能力明显降低，证实hOGG1326的多态性可能在个体间DNA损伤修复能力中起着重要的调控[15]。本次研究发现孕产妇的hOGG1Ser/Cys326基因型与体内1-OH-P的浓度有统计学意义(P < 0.05)，提示孕产妇hOGG1的突变基因型GG与体内1-OH-P的暴露有关，这与上述研究结果一致。本次研究只简要分析了乌鲁木齐市孕产妇尿液中1-OH-P浓度水平，将其作为PAHs暴露的内暴露剂量，而没有直接测血清总PAHs浓度，本研究分析了孕产妇及新生儿碱基修复基因多态性与PAHs暴露的关联，综合评价了乌鲁木齐市环境PAHs暴露对母婴DNA损伤状况。没有分析核苷酸修复系统(NER)中相关基因与PAHs暴露的关联，从而全面评价PAHs暴露对新生儿健康的影响。
随着工农业的发展，我国环境污染形势严峻，长时间、低剂量、多途径的PAHs暴露对于孕产妇及新生儿等弱势群体的健康影响受到了社会各界的广泛关注，探索母体暴露于PAHs暴露对子代影响的易感标志物具有深远的意义。此次研究仅对根据采集的数据按照不同暴露程度的孕产妇进行研究，进一步对PAHs的空气浓度及机体内代谢物1-OH-P浓度进行跟踪监测，综合评价携带hOGG1、XRCC1基因的机体暴露于PAHs环境中对孕产妇及子代健康的危害，为今后相关学科研究提供重要资料。
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