小鼠局部淋巴结BrdU-ELISA法(Local Lymph Node Assay:BrdU-ELISA，LLNA:BrdU-ELISA)是化学品(包括化妆品)皮肤致敏性检测的标准方法之一^[1]。其原理如下：机体接触外来致敏物后，局部的淋巴细胞会最先增生，在淋巴细胞增生过程中，用BrdU代替正常尿嘧啶掺入细胞DNA中，采用ELISA法检测淋巴结中BrdU的量，以BrdU的量来评价受试物致敏强度^[1]。该方法是小鼠局部淋巴结放射性法的改良方法^[1-2]。

在该实验过程中，如果小鼠耳朵局部的皮肤出现红斑水肿的症状(表现在耳厚差和耳重两个指标上)，则说明该受试物具有刺激性。具有刺激性的受试物不但能引起小鼠耳朵红斑水肿，同时也能引起耳后淋巴结细胞的增生，故小鼠一旦出现红斑水肿症状，则无法区别淋巴结的增生是由于刺激还是致敏引起的，需要降低浓度直到小鼠不出现红斑水肿症状后再进行下一步实验^[1-3]。这是该实验引入刺激指标的本意。所以大部分学者用BrdU-ELISA法检测致敏性的同时会检测刺激性以此来佐证、判断受试物的致敏性^[4-6]。该实验中刺激指标的应用仅仅是为了排除刺激性对实验结果的影响，但从另一个角度来说该实验也能对受试物刺激性进行“有或无”的判断，具有检测受试物皮肤刺激性的潜质。

该实验使用动物数量少，符合动物实验学“减少”，“替代”和“优化”的“3R”原则，同时具有实验时间短，指标灵敏、客观，较经典多次皮肤刺激实验有不可比拟的优势。在对一些只需了解是否有刺激性的受试物进行评价时，如果能将小鼠局部淋巴结BrdU-ELISA法应用于皮肤刺激性检测当中，能够减少受试动物的使用量并提高实验结果的可信度。

染发剂是一类特殊的化妆品，含有芳香胺类、氨基苯酚类、过氧化氢偶氮类、三苯甲烷、蒽醌或吲达胺类等，往往具有致敏性、刺激性、致癌性及致突变性等毒理学特性，其毒性不容忽视^[7]。在其安全性评价中，刺激性评价是重要的一个方面。

本实验随机选取15种染发剂，采用LLNA:BrdU-ELISA法和多次皮肤刺激实验进行刺激性检测，对比LLNA:BrdU-ELISA法检测染发剂刺激性的效能，为染发剂刺激性检测方法提供新思路。

1 材料和方法 1.1 实验动物

SPF级Balb/c小鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司(合格证号：SCXK(京)2014-0004)，雌性，8~12周龄，体重18~22 g。实验动物福利伦理审查编号：2016004。动物实验环境条件：SPF动物房，温度(22±2)℃，相对湿度60%~80%，12/12 h黑白交替照明。

白色成年、健康、皮肤无损伤家兔雌雄各半，购于北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司[合格证号：SCXK(京)2015-0005]，单笼饲养，常规饲料，自由饮水。

1.2 仪器和试剂

受试物：15种随机采购的不同品牌的染发剂，品牌A 2.0、品牌B 3.0、品牌C黑发霜882S、品牌C染发膏3 N、品牌C黑发霜8833S、品牌D无氨20、品牌B 53、品牌A 3.68、品牌A 4-5、品牌D 2/0、品牌A 3-0、品牌D 4/0、品牌E 2.2 N、品牌F 38、品牌G 3-0。

1.3 实验方法

1.3.1 LLNA:BrdU-ELISA法

按照OECD TG442(B)的标准方法进行^[1]，本实验只介绍耳厚差和耳重两个指标获取方法，具体如下：

雌性动物适应1周后随机分组，4只/组，称重并测量耳缘厚度^[1]。其次，进行受试物染毒。所有受试物均按照说明书上进行配制(例如有的需要A剂和B剂混合)，所有受试物均现配现用。于试验第1、2、3 d在小鼠双耳背部分别涂抹受试物25 μL，对照组不做处理。

第6天，测量耳厚并记录；颈椎脱臼处死小鼠，用打孔器取下耳廓直径9 mm的组织称重并记录。

耳厚差和耳重两个指标中只要有一个指标受试组与对照组相比差异统计学意义，则认为该受试物具有刺激性。

1.3.2 多次皮肤刺激实验

4只家兔/组，雌雄各半，试验前将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为3 cm×3 cm，涂抹面积2.5 cm×2.5 cm。受试物配置同LLNA: BrdU-ELISA法，现配现用。

染毒第1 d，取受试物约0.5 mL或者0.5 g涂抹在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14 d。从第2 d开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。1 h后观察结果，按《化妆品安全技术规范》(2015)版皮肤刺激反应评分表进行评分，对照区和试验区同样处理。按以下公式计算每天每只动物平均积分:

每天每只动物平均积分=(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14

按照《化妆品安全技术规范》(2015)版皮肤刺激强度分级判定皮肤刺激强度。0~0.5为无刺激性，0.5~2.0为轻度刺激性，2.0~6.0为中等刺激性，6.0~8.0为强刺激性。

1.3.3 统计分析方法

用SPSS 17.0对LLNA:BrdU-ELISA法实验结果进行分析，用单因素方差分析对耳后差和耳重两指标检测结果进行统计分析，如果差异有统计学意义，则进一步用Dunnt’T检验法对受试组与对照组进行两两比较。用配对χ²检验对LLNA:BrdU-ELISA和多次皮肤刺激实验结果进行比较。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 两方法刺激性检测结果

如表 1所示，LLNA:BrdU-ELISA实验结果中，耳厚差指标中，4号与对照组相比差异具有统计学意义，P＜0.05，其余受试物与对照组相比差异无统计学意义。耳重指标中，5号、8号、11号和13号与对照组相比差异具有统计学意义，P＜0.01。其余受试物与对照组相比差异无统计学意义。故LLNA:BrdU-ELISA实验中4号品牌C染发膏3N、5号品牌C黑发膏88338、8号品牌A3.68、11号品牌A3.0和13号品牌E2.2N具有刺激性。

多次皮肤刺激实验中，3号、7号、品牌C黑发霜882S、品牌B53和13号品牌E2.2N具有轻刺激性，4号品牌C染发膏3N和11号品牌B3-0具有中刺激性。

2.2 两方法结果比较

用配对卡方检验比较两方法刺激性判断能力。经计算，χ²为0.25，P>0.05，差异无统计学意义，可以认为两种方法对15种染发剂的刺激性检测能力没有差异(表 2)。

3 讨论

氧化型染发剂，因其染发效果好，不易褪色，更容易被消费者使用。但氧化型染发剂对健康危害较大，对皮肤具有一定的致敏性、刺激性和腐蚀性，可以引起接触性皮炎、过敏性皮炎等^[8]。

LLNA:BrdU-ELISA法实验持续时间短、操作相对简单、目前是化学品(包括化妆品、农药等)致敏性检测较为推广的方法^[1]。但其在受试物皮肤刺激性检测方面的研究相对较少。

本研究对比了该方法与多次皮肤刺激实验检测15种染发剂的结果，实验期间受试动物均没有明显异常表现和死亡现象。实验结果显示有11个受试物在两个实验中刺激性判断是一致的。但有4个受试物判断不一致，3号品牌C黑发霜882S和7号品牌B53在多次皮肤刺激实验中具有刺激性但在LLNA:BrdU-ELISA中是阴性结果，5号品牌C黑发霜8833S和8号品牌A3.68则在多次皮肤刺激实验中是阴性结果而在LLNA:BrdU-ELISA中却具有刺激性。发现这4种受试物都含有不同浓度的过氧化氢、氢氧化铵或氢氧化钾等刺激性化学物以及间苯二酚、苯二胺类致敏性化学物，故此4种受试物都有可能出现刺激性。另外，LLNA:BrdU-ELISA法采用的是小鼠，而多次皮肤刺激实验采用的是家兔，两种方法存在着动物物种的差异，且染毒次数和染毒方法并不相同，故可能导致两项实验判断不一致。

如果以多次皮肤刺激实验为标准，则LLNA:BrdU-ELISA法的灵敏度为3/5(60%)，特异度为8/10(80%)，且配对卡方检验初步判断两方法检测染发剂刺激性能力相当，可以认为LLNA:BrdU-ELISA法具有单独检测染发剂刺激性的潜能。

LLNA:BrdU-ELISA法缺点是只能用于对受试物刺激性进行有或无的判断，无法对受试物刺激程度进行分级，有待进一步研究。另外，本实验染毒时间以及染毒方式均是按照致敏性检测要求进行的，刺激性检测有无必要按照此染毒间隔时间进行，染毒次数和染毒方式有无必要进行更改，该方法检测受试物刺激性的能力是否稳定，这些都是今后需要深入探讨研究的问题。