, , , 抗生素是预防和治疗人类和动物感染性疾病的常用药，施用于动物的抗生素，大多数(60%~90%)以原药的形式通过粪便和尿液排出体外，可污染土壤、地表水、地下水，影响动物和微生物的正常生命活动[1]。长期滥用抗生素会导致体内及环境中耐药菌大量繁殖，破坏各种微生物种群数量和结构平衡，降低感染性疾病治愈的可能性，影响人体健康[2]。全世界水环境正受到抗生素污染，早在1999至2000年间，美国139条河流的80%检出了抗生素，其中检出频率较高的有磺胺甲唑、脱水红霉素、林可霉素等[3]；西班牙和瑞士多条河流、英国莱因河、意大利波河和亚诺河、法国塞纳河等都检出抗生素[4]。中国地表水也检出多种抗生素，还曾检出90种非抗生素类医药成分[5]。
我国还没有饮用水中抗生素的标准检验方法，目前常用的检测方法有气相色谱—质谱联用[6]、液相色谱—二极管阵列(HPLC/DAD)[7]、液相色谱—荧光(HPLC/FD)[8]、液相色谱—串联质谱法(LC-MS-MS)[9-12]。前处理方法有固相萃取法[13-14]、分散液—液微萃取法(DLLME)等[15-16]。DLLME利用分析物在基质和有机溶剂中的溶解度差异进行分离，使用较少的有机溶剂，经济环保，是传统液—液萃取法的改进形式。本文研究样品前处理方法，建立简便、灵敏的DLLME-LC/DAD方法，可用于水中痕量抗生素的测定。
1 材料与方法 1.1 材料、仪器与试剂Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Sigma 3-30KS离心机(德国SIGMA公司)，超声清洗器(美国Branson公司)。
甲硝唑、红霉素、氯霉素、土霉素、金霉素、美满霉素、四环素、多西环素盐酸盐、阿莫西林标准品(上海安普谱公司)。乙腈、甲醇、丙酮、氯仿、四氯化碳(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，其它有机溶剂由广州化学试剂厂产生。
准确称取适量的甲硝唑、红霉素、氯霉素、土霉素、金霉素、美满霉素、四环素、多西环素盐酸盐、阿莫西林标准品，溶于水，转移到棕色瓶中定容，配制成浓度为500.0 mg/L标准储备液，置于4℃冰箱中保存。混合标准系列溶液临用现配，分别移取适量的抗生素储备液于棕色瓶中，加水定容。
1.2 色谱条件色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温30℃；0.01 mol/L草酸和混合溶剂(甲醇-乙腈=1+1，V/V)按73 :27(V/V)比例混合所得溶液作为流动相，流速0.8 mL/min；紫外检测波长280 nm；进样量20 μL。
1.3 样品处理移取15.0 mL水样于具塞离心管中，用盐酸调pH值为4，加入NaCl 1.5 g、乙腈0.2 mL，用注射器快速注入0.5 mL正戊醇-甲基叔丁醚混合溶剂(4 :1)，形成乳浊液，涡旋4 min，于8 000 rpm(有效离心半径15 cm)离心2 min，用注射器抽取上层有机层，氮吹蒸干，加入0.5 mL流动相溶解残渣，经0.45 μm滤膜过滤后测定。
1.4 质量控制用自来水配制含9种抗生素(10.0 μg/L)的质控水样，用于萃取条件优化，萃取实验进行3次平行测定，计算富集倍数。富集倍数为萃取平衡后，抗生素在萃取剂中的浓度与原水样中的浓度之比用ER表示。对水样进行高、中、低浓度加标实验，分别5次平行测定，评价方法的准确性。空白实验的结果应小于检出限。
2 结果与讨论 2.1 分散液—液微萃取条件优化 2.1.1 萃取剂的选择在5份pH为4.0的质控水样中，分别加入0.5 mL正戊醇、异戊醇、甲基叔丁醚、乙酸丁酯或邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯作为萃取剂，并以0.15 mL乙腈为分散剂，进行萃取实验，结果表明，正戊醇对土霉素、多西霉素、红霉素的富集倍数较高，而甲基叔丁醚对红霉素、多西霉素、氯霉素、美满霉素抗生素的富集倍数较高。因此，两种溶剂混合可起到一定的互补效果。进一步实验发现，正戊醇和甲基叔丁醚按4 :1混合，抗生素的富集倍数较高(图 1)。
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| 注：ER为抗生素在萃取剂中的浓度与原水样中的浓度之比 图 1 不同比例混合溶剂的富集倍数 |
2.1.2 萃取剂体积
实验以0.15 mL乙腈作为分散剂，且其它条件不变，比较混合溶剂(正戊醇—甲基叔丁醚4 :1)体积分别为0.40、0.50、0.70、0.80、1.0 mL时，对9种抗生素的富集倍数。富集倍数先随体积的增加而增大，当体积增大到0.50 mL时，ER值在2.3~8.5之间，萃取效率较高，然后，随着萃取剂体积增大而稍微下降，因此，选择0.50 mL为最佳萃取体积。
2.1.3 分散剂的种类和体积实验考察甲醇、乙醇、乙腈、丁酮作为分散剂，对富集倍数的影响，结果表明，以乙腈为分散剂，9种抗生素均有较好的富集倍数(ER值2.2~8.4)。实验考察了乙腈的用量分别为50、100、150、200、300 μL时，对富集倍数的影响。当乙腈体积增大，抗生素的ER值也增大，乙腈用量为150 μL时，ER值2.4~8.6，富集倍数最高，因此，分散剂用量150 μL最合适。
2.1.4 水样pH水样pH能改变抗生素的存在形态，从而影响分散液—液微萃取的效果。在其它条件不变的情况下，测定不同pH的质控水样。pH分别为1.50、2.05、3.50、4.05、6.01、8.00、9.05和11.00时，9种抗生素的ER值(图 2)，红霉素和美满霉素的ER值随水样pH增大而增大，因为两者在酸性溶液中不稳定，影响富集倍数；其它7种抗生素的ER值，先随pH值增大而增加，当pH值大于4.05时，ER值下降，尤其是阿莫西林、土霉素、氯霉素的ER值明显下降，因为3种抗生素在碱性条件下不稳定。
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| 注：ER为抗生素在萃取剂中的浓度与原水样中的浓度之比 图 2 水样pH对抗生素富集倍数的影响 |
2.1.5 盐效应
固定其它条件不变，在15 mL质控水样中分别添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g NaCl，测定9种抗生素的ER值。结果表明，回收到的溶剂体积，随NaCl添加量的增加而增多。当添加量为1.5 g (10%)时，ER达到恒定值(2.4~8.9)，富集倍数高，因此，适宜的NaCl添加量为10%。
2.1.6 萃取时间在其它条件不变的情况下，实验考察萃取时间为1、2、4、6和8 min的富集倍数，结果表明，ER值随萃取时间的增加而增大，但4 min后，ER值不再明显增加(图 3)，因此，萃取时间4 min较合适。
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| 注：ER为抗生素在萃取剂中的浓度与原水样中的浓度之比 图 3 萃取时间对抗生素富集倍数的影响 |
2.2 线性范围、精密度与检出限
配制5个混合标准系列溶液，浓度范围5.00~50.0 μg/L，分别测定峰面积，制作标准曲线。对5.0 μg/L抗生素的加标水样连续7次测定，计算标准偏差s，及3 s、10 s值，再除以水样浓缩倍数30(15 mL水样浓缩到0.5 mL溶剂中)，得到方法的检出限(LOD=3 s/30)和定量限(LOQ=10 s/30)。对浓度为25.0 μg/L加标水样连续5次测定，计算相对标准偏差(RSD)，得到精密度(表 1)。相关系数0.998 1~0.999 4，线性关系良好，方法的检出限(0.43~1.57)μg/L、定量限(1.33~5.33)μg/L，RSD 0.35%~3.8%，方法的灵敏度高、精密度好。
| 抗生素 | 线性方程 | 相关系数/ r |
方法LOD/ (μg/L) |
方法LOQ/ (μg/L) |
精密度/ (RSD，%) |
| 美满霉素 | y=69.259c-0.569 3 | 0.999 2 | 0.43 | 1.33 | 0.95 |
| 甲硝唑 | y=33.212c+0.318 3 | 0.998 9 | 0.63 | 2.00 | 0.35 |
| 阿莫西林 | y=25.411c-0.196 3 | 0.998 1 | 0.90 | 3.33 | 1.2 |
| 土霉素 | y=47.943c+0.140 0 | 0.998 6 | 0.83 | 2.67 | 3.4 |
| 四环素 | y=17.527c+0.311 8 | 0.998 7 | 1.17 | 4.00 | 3.8 |
| 金霉素 | y=12.245c-0.306 0 | 0.999 4 | 1.40 | 4.67 | 1.0 |
| 多西环素 | y=17.295c+0.034 45 | 0.999 1 | 1.43 | 4.67 | 1.5 |
| 红霉素 | y=26.581c-0.200 9 | 0.999 3 | 1.47 | 5.00 | 3.0 |
| 氯霉素 | y=36.279c+0.127 13 | 0.998 3 | 1.57 | 5.33 | 1.2 |
2.3 实际水样测定
为验证方法的适用性，采用DLLME方法萃取实验室自来水和马涌河生活污水中的抗生素，HPLC测定。自来水中9种抗生素浓度均小于检出限，生活污水可检出2种抗生素。对生活污水加标高、中、低3个浓度，用于回收率测定，5次测定的平均回收率为66.4%~94.0%，相对标准偏差为1.5%~6.5%(表 2)。混合标准溶液及水样加标色谱图见图 4。
| 抗生素 | 原水样/ (μg/L) |
加标浓度/ (μg/L) |
测定值平均值/ (μg/L) |
回收率/ % |
精密度 (RSD，%) |
| 美满霉素 | 85.5 | 5.00 | 89.2 | 74.0 | 3.6 |
| 10.0 | 94.5 | 90.0 | 4.2 | ||
| 25.0 | 109 | 94.0 | 3.1 | ||
| 甲硝唑 | - | 5.00 | 4.02 | 80.4 | 4.3 |
| 10.0 | 8.89 | 88.9 | 2.5 | ||
| 25.0 | 21.5 | 86.0 | 1.8 | ||
| 阿莫西林 | 115 | 5.00 | 119 | 80.0 | 4.6 |
| 10.0 | 124 | 90.0 | 3.2 | ||
| 25.0 | 137 | 88.0 | 3.8 | ||
| 土霉素 | - | 5.00 | 4.52 | 90.4 | 2.9 |
| 10.0 | 8.76 | 87.6 | 4.1 | ||
| 25.0 | 23.1 | 92.4 | 3.7 | ||
| 四环素 | - | 5.00 | 4.23 | 84.6 | 4.7 |
| 10.0 | 7.98 | 79.8 | 3.8 | ||
| 25.0 | 22.7 | 90.8 | 1.7 | ||
| 金霉素 | - | 5.00 | 4.14 | 82.8 | 3.6 |
| 10.0 | 9.28 | 92.8 | 4.3 | ||
| 25.0 | 22.7 | 90.8 | 4.8 | ||
| 多西环素 | - | 5.00 | 4.03 | 80.6 | 1.5 |
| 10.0 | 8.97 | 89.7 | 3.8 | ||
| 25.0 | 22.4 | 89.6 | 2.9 | ||
| 红霉素 | - | 5.00 | 3.32 | 66.4 | 4.9 |
| 10.0 | 9.17 | 91.7 | 2.9 | ||
| 25.0 | 23.4 | 93.6 | 5.2 | ||
| 氯霉素 | - | 5.00 | 4.12 | 82.4 | 6.5 |
| 10.0 | 9.08 | 90.8 | 1.8 | ||
| 25.0 | 23.4 | 93.6 | 2.6 | ||
| 注：“-”为未检出 | |||||
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注：a-水样浓度：美满霉素90.0 μg/L，阿莫西林122 μg/L；b-加标水样加标浓度50.0 μg/L 色谱峰：1-美满霉素、2-甲硝唑、3-阿莫西林、4-土霉素、5-四环素、6-金霉素、7-多西环素、8-红霉素、9-氯霉素 图 4 混合标准液及水样加标色谱图 |
3 结论
本文建立了DLLME-LC测定水中9种抗生素的方法。方法操作简便，消耗有机溶剂少，实验成本低，萃取效率好，具有灵敏度高、精密度好、准确可靠等优点，可用于水样中痕量的多种抗生素萃取测定。
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