2. 山西医科大学公共卫学院劳动卫生学教研室
, 铝是地壳中含量最高的金属元素，可通过环境、饮食和药物等途径进入人体[1]。许多研究已证实铝具有明显神经毒性，与阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)等神经退行性疾病的发生密切相关[2]，是导致AD的重要环境危险因素[3]。进行性神经元死亡是AD等神经退行性疾病的最主要特征[4]，以往研究证实，铝可引起神经元死亡[5]，但铝致神经元死亡的确切机制目前尚未阐明[6]。铁死亡是由Dixon等[7]于2012年新发现的一种细胞死亡方式，细胞质和脂质活性氧(reactive oxygen species, ROS)增多、线粒体变小及线粒体膜密度增加是其标志性表现。进一步研究发现，铁死亡与Fe含量和谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量密切相关[8-9]，且可能在AD等神经退行性疾病发生过程中起重要作用[7]。但是，铁死亡是否参与了铝致神经元死亡的过程尚未见相关报道。麦芽酚铝[aluminum-maltolate, Al(mal)3]是一种呈电中性的含铝复合物，与AlCl3和乳酸铝等其他铝染毒剂相比在生理pH条件下，是可溶性的且不易发生水解反应形成氢氧化铝沉淀，能够释放更多铝离子，对动物和神经元细胞的毒性更强，更有利于进行铝负荷的神经毒理学研究[10-11]。因此，本研究通过亚慢性Al(mal)3染毒SD大鼠制备铝神经毒性动物模型，观察铝对大鼠神经行为的影响，并通过观察大鼠神经元线粒体超微结构改变、GSH含量及Fe含量，探讨铁死亡在铝致神经元死亡中的作用及其可能的机制，为进一步研究铝致AD的机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料 1.1.1 研究对象健康雄性SPF级SD大鼠18只，鼠龄6周，体重(180~200) g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(军)2012—0004。大鼠饲养在温度20℃~22℃，相对湿度40%~60%的环境，饲喂普通饲料，自由饮水和进食。饲养大鼠用笼具、饮水瓶等均不含铝。本动物实验通过山西医科大学伦理委员会审查(编号：2018027)。
1.1.2 主要仪器Morris水迷宫、旷场实验箱(中国医学科学院药物研究所)；Smart v3.0图像分析采集系统(深圳沃德科技有限公司)；UV-2102C分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；JEM-1011透射电子显微镜(日本电子株式会社)；低温高速离心机(Heal Force)；iMark酶标仪(美国BIO-RAD公司)；-80℃超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)。
1.1.3 主要试剂氯化铝(纯度为97%，天津市风船化学试剂科技有限公司)；麦芽酚(纯度为99%，美国sigma-aldrich公司)；注射用青霉素钠(400万单位，华北制药股份有限公司)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(北京Solarbio公司)；BCA蛋白定量试剂盒(生工生物工程股份有限公司)；组织铁测试盒、微量还原型谷胱甘肽测试盒(南京建成生物工程研究所)
1.1.4 染毒液配制麦芽酚铝溶液的配制参照文献[12]方法略加修改，将氯化铝溶于生理盐水中，配成终浓度为18和36 mmol/L氯化铝溶液；将麦芽酚溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，配制成终浓度为54和108 mmol/L麦芽酚溶液，将两种溶液等体积混合后用震荡混匀器混匀(麦芽酚对铝具有极高的亲和力，氯化铝溶液和麦芽酚溶液按照1 :3的比例反应生成Al(mal)3，即1Al3++3mal→1Al(mal)3)，配制成浓度为9和18 mmol/L Al(mal)3溶液，用NaOH溶液调溶液pH为7.2~7.4，0.22 μm滤膜对其进行抽滤，临用时现配。
1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及处理将18只SD大鼠按体重随机分成3组，分别为：生理盐水组、9和18 μmol/kg Al(mal)3染毒组，每组6只动物。采用腹腔注射Al(mal)3染毒，0.1 mL/100 g，1次/d，连续染毒90 d。生理盐水组大鼠每日注射相同体积生理盐水。染毒时间固定在每天上午9:00—11：00。大鼠每月腹腔注射青霉素(2万单位/只)防感染。每天记录大鼠状态，每周定时称量大鼠体重，以此调整注射体积。染毒结束后，进行神经行为学测试包括水迷宫实验和旷场实验两部分。
1.2.2 Morris水迷宫实验(Morris water maze, MWM)MWM包括定位航行实验和空间探索实验。实验方法参照文献[12]略加改动。①定位航行实验：将大鼠头朝池壁放入水中并开始计时，追踪系统自动记录大鼠入水到找到平台所需的时间，即逃避潜伏期。若大鼠在2 min内跳上平台，并在平台上停留5 s，系统会自动停止计时；若2 min内大鼠未找到平台，将大鼠引上平台并停留15 s，潜伏期按2 min计算。每天4次，每次间隔20 min，共5 d。4次逃避潜伏期时间的平均值作为当日最终时间进行最后统计。②空间探索实验：第6 d撤去平台，将大鼠头朝池壁从离原平台最远的西南入水点放入水中，记录2 min内大鼠找到原平台位置所需时间和穿越原平台位置的次数。
1.2.3 旷场实验(open field test, OFT)OFT测定方法参照文献[12]略加改动。将大鼠放入箱内底面正中心时开始摄像并计时，记录10 min内大鼠在中央格停留时间、竖起次数和修饰次数(大鼠每完成一系列用前爪洗脸的动作即为一次修饰)。每只大鼠实验完毕，清洗擦拭旷场箱内壁及底面，更换大鼠继续实验。
1.2.4 大鼠脑组织神经元超微结构观察神经行为学测试结束后，从每组随机选取3只大鼠麻醉后腹主动脉取血，然后迅速在冰上断头取大脑，并将其切成1 mm3大小组织块，置于戊二醛固定液中，4℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，1%锇酸室温固定2 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次。丙酮系列脱水每级15 min，浸透包埋组织，3%醋酸铀—枸橼酸铅双染色后超薄切片机切片，切片室温干燥过夜，透射电子显微镜观察。
1.2.5 大鼠脑组织GSH和Fe含量测定测定方法按照试剂盒说明书进行操作。
1.3 统计分析采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，定位航行实验采用重复测量的方差分析；空间探索实验、OFT及大鼠海马组织GSH和Fe含量的组间比较采用单因素方差分析；检验水准为0.05。
2 结果 2.1 大鼠一般状况整个实验过程中，生理盐水组大鼠生长发育正常，未见任何异常表现。随染毒剂量升高，各染毒组大鼠皮肤光泽欠佳、脱毛、反应迟钝等情况逐渐加重。
2.2 Morris水迷宫实验(MWM)结果MWM定位航行试验中，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间延长明显缩短(F=49.118，P=0.000)。各Al(mal)3染毒组大鼠第5天的逃避潜伏期较生理盐水组明显缩短，差异有统计学意义(P < 0.05；表 1)。
| 组别 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 |
| 生理盐水组 | 44.25±26.41 | 15.45±9.59 | 11.16±2.18 | 13.51±6.07 | 12.72±1.04 |
| 9 μM/kg Al(mal)3组 | 44.61±41.14 | 25.44±14.82 | 14.66±11.29 | 12.35±5.85 | 8.39±2.85a |
| 18 μM/kg Al(mal)3组 | 56.03±46.81 | 22.53±6.00 | 12.57±7.95 | 10.49±3.89 | 7.97±2.75a |
| 注：“a”为与生理盐水组比较，P < 0.05 | |||||
在空间探索实验中，各Al(mal)3染毒组大鼠找到原平台位置的时间随Al(mal)3染毒剂量增加而逐渐延长，与生理盐水组相比，差异具有统计学意义(P < 0.05)。各染毒组大鼠穿越原平台位置次数与生理盐水组相比相对减少，但差异没有统计学意义(P > 0.05；表 2)。
| 组别 | 找到原平台位置时间/s | 穿越原平台位置次数/次 |
| 生理盐水组 | 8.60±3.01 | 5.83±2.14 |
| 9 μmol/kg Al(mal)3组 | 9.48±3.70a | 4.83±0.75 |
| 18 μmol/kg Al(mal)3组 | 17.48±4.84ab | 3.67±1.03 |
| 注：a与生理盐水组比较，P < 0.05；b与9 μM/kg Al(mal)3组比较，P < 0.05 | ||
2.3 旷场实验(OFT)结果
随Al(mal)3染毒剂量升高，各染毒组大鼠中央格停留时间明显延长，竖起次数明显减少，差异具有统计学意义(P < 0.05)；各染毒组大鼠修饰次数与生理盐水组相比相对减少，但差异无统计学意义(P > 0.05)。18 μmol/kg Al(mal)3染毒组大鼠中央格停留时间与生理盐水组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)；各染毒组大鼠竖起次数与生理盐水组相比，差异均有统计学意义(P < 0.05;表 3)。
| 组别 | 中央格停留时间/s | 竖起次数/次 | 修饰次数/次 |
| 生理盐水组 | 29.88±16.13 | 59.33±6.92 | 10.83±3.82 |
| 9 μmol/kgAl(mal)3组 | 42.83±12.23 | 75.33±3.93a | 9.67±3.72 |
| 18 μmol/kgAl(mal)3组 | 51.27±9.34a | 74.17±5.64a | 6.67±2.16 |
| 注：“a”为与生理盐水组比较，P < 0.05 | |||
2.4 脑组织电镜结果
由图 1(见封三)可知，生理盐水组大鼠神经元线粒体形态饱满，表面光滑，膜结构完整，膜密度正常，线粒体嵴清晰可见(A)。随Al(mal)3染毒剂量增高，线粒体出现明显皱缩、膜密度明显增加和嵴消失等铁死亡特征性表现(B、C)。
|
| 注：黑色粗箭头指示线粒体大小及膜密度变化；黑色细箭头指示线粒体嵴变化 图 1 各组大鼠脑组织线粒体超微结构变化 |
2.5 大鼠脑组织GSH含量测定结果
随Al(mal)3染毒剂量升高，脑组织GSH含量逐渐减少，各Al(mal)3染毒组脑组织GSH含量与生理盐水组相比明显下降，差异均有统计学意义(P < 0.05;表 4)。
| 组别 | GSH含量/(μmol/gprot) |
| 生理盐水组 | 26.62±0.65 |
| 9 μmol/kg Al(mal)3组 | 23.15±1.73a |
| 18 μmol/kg Al(mal)3组 | 18.31±3.44a |
| 注：“a”为与生理盐水组比较，P < 0.05 | |
2.6 大鼠脑组织铁含量测定结果
随Al(mal)3染毒剂量增加，大鼠脑组织Fe含量逐渐升高，其中，18 μmol/kg Al(mal)3组大鼠脑组织Fe含量与生理盐水组相比，差异具有统计学意义(P < 0.05；表 5)。
| 组别 | Fe含量/(μmol/gprot) |
| 生理盐水组 | 0.58±0.30 |
| 9 μmol/kg Al(mal)3组 | 1.22±0.24 |
| 18 μmol/kg Al(mal)3组 | 5.16±2.52a |
| 注：“a”为与生理盐水组比较，P < 0.05 | |
3 讨论
铝具有明显神经毒性，在AD等神经退行性疾病的发生发展过程中起重要作用[2]。本研究发现，亚慢性Al(mal)3染毒可以导致大鼠学习记忆能力和自主活动能力下降，与以往研究结果一致[12]。神经元是神经系统的基本结构和功能单位，是学习记忆的物质基础，其数量多少与其功能密切相关，而神经元死亡是AD的特征性病理表现之一[1]。研究表明，铝可通过凋亡、坏死、自噬、程序性坏死等导致神经元死亡[5, 13]，但其确切机制仍未阐明。
目前认为，铁死亡是一种由铁依赖的氧化损伤引起的细胞死亡方式，其主要特点为ROS增多和线粒体的特异性改变(线粒体皱缩、线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少或消失)[14]。这在形态学上与凋亡、坏死、自噬等其他细胞死亡方式的典型形态学特征均存在显著差别。本研究结果显示，亚慢性Al(mal)3染毒可以导致大鼠神经元线粒体出现明显皱缩、双层膜密度增加及线粒体嵴消失，与铁死亡相关文献结果一致[7, 14]。提示亚慢性Al(mal)3染毒可以诱导大鼠神经元发生铁死亡。
以往研究证实，铁死亡的发生机制为：细胞内GSH含量下降引起细胞内GSH过氧化物酶(glutathioneperoxidase, GSH-Px)活性下降，导致脂质氧化物不能经GSH-Px催化的GSH还原反应代谢，继而Fe2+以类似Fenton反应的方式氧化脂质产生大量ROS，最终导致细胞铁死亡[9, 14-15]。本实验发现，随Al(mal)3染毒剂量升高，各染毒组大鼠脑组织GSH含量逐渐减少，而Fe含量逐渐增加，与以往铁死亡研究中GSH和Fe含量变化趋势一致[16-18]。提示，神经元GSH和Fe含量改变可能在亚慢性Al(mal)3染毒致大鼠神经元铁死亡过程中起重要作用。
综上所述，亚慢性Al(mal)3染毒可致大鼠神经元铁死亡，脑组织GSH含量减少、Fe2+积累可能是Al(mal)3诱导大鼠神经元铁死亡的机制之一。
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